一种用于检测血浆中CRP的荧光侧流免疫层析试纸条

本发明属于c反应蛋白检测领域，具体涉及一种用于检测血浆中c反应蛋白的荧光侧流免疫层析试纸条。

背景技术：

1、c反应蛋白(creactive protein，crp)是一种炎症标志蛋白，在身体发生相关损伤的情况下产生，包括炎症感染、坏死、创伤、恶性肿瘤和癌症、心血管疾病等。除了作为炎症的生物标志物外，crp最近被确定为心血管疾病(cvd)的独立风险指标。在炎症过程中，包括急性感染和自身免疫性疾病，血浆中crp浓度可分为正常小于10 μg/ml、炎症大于15 μg/ml和严重感染约为200 μg/ml。同时，作为心血管疾病的优秀生物标志物，有必要在0.1 ~ 3.0μg/ml范围内检测高敏感crp (hs-crp)。crp和hs-crp检测已被开发用于评估预防不同疾病的目的。因此，灵敏、准确地测定血浆中crp和hs-crp水平对急性感染和心血管疾病的诊断具有积极的临床价值。目前，常规的crp定量检测方法主要有化学发光法、乳胶增强免疫比浊法和酶联免疫分析法(elisa)。然而，上述方法需要在实验室进行，并由专业操作人员执行，仪器昂贵，操作规程复杂。开发一种快速、灵敏、便携的crp检测方法，对资源有限地区的临床应用十分有益。

2、侧流免疫层析（lateral flow immunoassay，lfia）是一种基于抗原、抗体免疫反应的经典即时检测（point of care testing，poct）。经典的基于胶体金纳米粒子(gnps)的侧流免疫流层析试纸条如图1所示，由样品垫2（用于加样）、结合垫3、层析膜4和吸水垫5（用于吸收多余样品液体防止回流）按顺序部分叠加固定于支撑背板1上，结合垫3上包被有gnps标记的生物活性材料，它可与待检样品溶液里的检测靶标结合形成免疫复合物，层析膜4上有两条喷印的检测线41（t线）和质控线42（c线），分别包被有不同生物活性物质（如抗原或抗体），用于拦截带标记的免疫复合物。遗憾的是，由于血浆基质复杂，传统比色lfia容易受到背景干扰，不适用于血浆中低含量靶标的高灵敏度检测。负载有染料的荧光微球因其易于合成、灵敏度高、准确度足够和定量结果满意等优点，引起了lfia领域越来越多的关注，被用作lfia的信号标记，但传统的有机荧光染料在聚集态下由于π−π堆积和其他非辐射二聚体的形成引起的聚集诱导猝灭(acq)效应而表现出较低的荧光发射，在lfia的应用场景中只适用于血清或水，无法在未经处理的全血中进行检测。

技术实现思路

1、基于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于检测血浆中crp的荧光侧流免疫层析试纸条，以实现快速、灵敏、便携的检测血浆中的crp。

2、一种用于检测血浆中crp的荧光侧流免疫层析试纸条，包括依次固定在支撑背板上的样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，所述层析膜设有检测线和质控线，其特点在于：所述结合垫包被有与荧光微球偶联的抗crp单克隆抗体i，所述检测线包被有抗crp单克隆抗体ii，所述质控线包被有山羊抗小鼠igg，所述荧光微球为包埋有荧光染料的聚苯乙烯微球，荧光染料的化学结构式如下：

3、 。

4、优选地，所述与荧光微球偶联的抗crp单克隆抗体i的包被量为10~60μg/cm。

5、所述抗crp单克隆抗体i通过edc法与所述荧光微球偶联，使抗crp单克隆抗体i与荧光微球以酰胺键的形式链接。

6、所述偶联的过程包括：将所述荧光微球、edc盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺在ph缓冲液中混合活化一定时间，然后加入抗crp单克隆抗体i孵育一定时间，最后加入封闭剂进行封闭。

7、优选地，所述抗crp单克隆抗体i与荧光微球的质量比为50~130:1000。

8、优选地，所述ph缓冲液为ph=7.4的硼酸盐缓冲液。

9、优选地，荧光微球、edc盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的质量比为2:1:1。

10、优选地，所述封闭剂为牛血清蛋白。

11、优选地，所述抗crp单克隆抗体ii的包被量为0.2~1μg/cm。

12、优选地，所述山羊抗小鼠igg的包被量为1μg/cm。

13、优选地，所述荧光染料与聚苯乙烯微球的质量比为1~5:10~100。

14、一种荧光染料，具有如下化学结构式：

15、 。

16、上述荧光染料的制备方法，包括在叔丁醇钾的作用下，4,6-二甲基-2-(甲硫基)嘧啶与4-(n,n-二乙基)氨基苯甲醛研磨反应得到所述荧光染料，优选地，叔丁醇钾与4,6-二甲基-2-(甲硫基)嘧啶的摩尔比为5:1。

17、一种荧光微球，所述荧光微球为包埋有如上所述的荧光染料的聚苯乙烯微球。

18、所述包埋的过程包括：将荧光染料的四氢呋喃溶液与含表面活性剂的聚苯乙烯微球水分散液混合震荡一定时间后，加热使四氢呋喃挥发完后，固液分离，洗涤，即得到荧光微球。

19、优选地，所述聚苯乙烯微球为羧基聚苯乙烯微球。

20、优选地，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠。

21、优选地，所述表面活性剂与聚苯乙烯微球的质量比为0.2~0.3:1。

22、上述荧光染料在制备检测血浆中crp的荧光侧流免疫层析试纸条中的应用。

23、有益效果：

24、 1、本发明的荧光微球生物相容性高、造价便宜、易于大批量生产，无需后续信号放大即可实现对crp的高敏感检测。

25、2、相比贵金属胶体金，本发明降低试纸条原材料的毒性，为环境减轻负担。

26、3、本发明的荧光侧流免疫层析试纸条检测crp时无需对血浆进行处理，可用于家庭个人健康管理，具有快速、灵敏、便携的优势，对资源有限地区的临床应用十分有益。

技术特征：

1.一种用于检测血浆中crp的荧光侧流免疫层析试纸条，包括依次固定在支撑背板上的样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，所述层析膜设有检测线和质控线，其特征在于：所述结合垫包被有与荧光微球偶联的抗crp单克隆抗体i，所述检测线包被有抗crp单克隆抗体ii，所述质控线包被有山羊抗小鼠igg，所述荧光微球为包埋有荧光染料的聚苯乙烯微球，荧光染料的化学结构式如下：

2.根据权利要求1所述的荧光侧流免疫层析试纸条，其特征在于：所述与荧光微球偶联的抗crp单克隆抗体i的包被量为60μg/cm。

3.根据权利要求1所述的荧光侧流免疫层析试纸条，其特征在于：所述抗crp单克隆抗体i与荧光微球的质量比为50~130:1000。

4.根据权利要求1所述的荧光侧流免疫层析试纸条，其特征在于：所述抗crp单克隆抗体ii的包被量为1μg/cm。

5.根据权利要求1所述的荧光侧流免疫层析试纸条，其特征在于：所述山羊抗小鼠igg的包被量为1μg/cm。

6.根据权利要求1所述的荧光侧流免疫层析试纸条，其特征在于：所述荧光染料与聚苯乙烯微球的质量比为1~5:10~100。

技术总结本发明公开了一种用于检测血浆中CRP的荧光侧流免疫层析试纸条，包括依次固定在支撑背板上的样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，所述层析膜设有检测线和质控线，其特征在于：所述结合垫包被有与荧光微球偶联的抗CRP单克隆抗体I，所述检测线包被有抗CRP单克隆抗体II，所述质控线包被有山羊抗小鼠IgG，所述荧光微球为包埋有荧光染料的聚苯乙烯微球，荧光染料的化学结构式如下：。与现有技术相比，本发明的荧光侧流免疫层析试纸条无需对血浆进行处理即可实现血浆中CRP的高敏感检测，可用于家庭个人健康管理，具有快速、灵敏、便携的优势，对资源有限地区的临床应用十分有益。技术研发人员：薛中华,孙盼盼,李倩,罗明月,常温卓受保护的技术使用者：西北师范大学技术研发日：技术公布日：2024/8/20