新分析方法和治疗哈钦森-吉尔福德早衰综合征的新方法与流程

本公开涉及新开发的免疫分析，其可以高灵敏度地检测早衰蛋白(progerin)，但不检测野生型核纤层蛋白a(lamin a)，还涉及用于诊断、预后和治疗早衰症的新方法。政府支持的致谢本发明是部分在美国食品和药物管理局授予的批准号为1u01fd006886-01的政府资助下完成的。政府对本发明拥有一定的权利。

背景技术：

1、哈钦森-吉尔福德早衰综合征(hutchinson-gilford progeria syndrome,hgps)是一种非常罕见(患病率为一千八百万到两千万活着的个体中有一个)、普遍致命的早衰疾病。没有性别、种族或地区趋势。发病包括成长受阻、全身性脂肪营养不良、脱发、骨骼发育不良和进行性动脉粥样硬化，导致主要死于心力衰竭的平均年龄为14.6岁。

2、hgps是散发性常染色体显性遗传病，由lmna突变引起，这种突变会产生核膜蛋白核纤层蛋白a的毒性剪接变体，称为早衰蛋白(de sandre-giovannoli等人；eriksson等人)。百分之九十的病例为典型的hgps，由c.1824c>t的点突变引起；其余10％的病例为非典型hgps，由内含子11的剪接体识别序列中的单碱基突变引起(gordon等人，2018；gordon等人，2014)。早衰蛋白以显性抑制方式发挥作用；导致疾病的是早衰蛋白的存在，而不是正常核纤层蛋白a水平的相对降低(scaffidi等人)。作为支持，缺乏核纤层蛋白a的小鼠也表现出正常的表型(fong等人)。小鼠研究支持早衰蛋白的剂量效应，研究显示杂合与同合早衰蛋白表达小鼠具有分级的疾病严重程度和寿命缩短，而接受早衰蛋白靶向治疗的hgps小鼠寿命延长(benedicto等人；cabral等人)。有病例报告称，轻度和重度早衰患者的成纤维细胞培养物分别表达了低水平和高水平的早衰蛋白(bar等人；hisama等人)。

3、与核纤层蛋白a不同的是，早衰蛋白缺乏锌金属蛋白酶的裂解位点，导致它持续保持法尼基化，从而掺入核纤层并作为核纤层的一部分长期存在，并在其中积聚，对细胞造成损伤。体外、小鼠模型和人体研究表明，通过抑制法尼基化，可以延缓和/或逆转hgps的表型。针对hgps患儿的临床试验表明，使用法尼基转移酶抑制剂(fti)洛那法尼(lonafarnib)治疗对心血管、骨骼、听力和体重均有益处(gordon等人，2012)，而且伴随平均存活时间延长约2.5年。综合该证据，结果是洛那法尼成为有史以来首个获得fda批准的用于hgps的治疗的药物。

4、目前还没有有效的hgps生物标志物。由于早衰蛋白是致病蛋白，因此是最佳的候选生物标志物，虽然已经在人体尸检组织和皮肤活检组织中使用免疫荧光法或elisa检测到早衰蛋白，但这些方法的灵敏度和定量程度不足以用于临床应用，而且组织检测对于获得连续的患者样品是不可行的。由于之前公认免疫分析方法具有局限性，最近开发出了替代免疫分析的靶向质谱方法(camafeita等人)。然而，这种方法的临床实用性可能也受到限制。

5、因此，为了评估治疗疗效，仍然需要以灵敏、特异的方式检测能够从hgps患儿纵向获取的生物材料中的早衰蛋白的方法。尽管目前正在进行的工作(参见在线网站grantome.com/grant/nih/u01-fd006886-01)旨在验证早衰蛋白作为生物标志物的有效性，但之前并未证明对早衰蛋白的灵敏检测可用于诊断或预后目的，也未证明对早衰蛋白的灵敏检测的灵敏度足以监测患者中的早衰蛋白响应特定hgps治疗的变化。

技术实现思路

1、本文描述了用于对象中哈钦森-吉尔福德早衰综合征(hgps)的预后的方法，该方法包括以下步骤：提供来自对象的样品；用定量免疫分析对样品中的早衰蛋白浓度进行定量，其中定量免疫分析检测早衰蛋白，但不检测野生型核纤层蛋白a蛋白；和将样品中的早衰蛋白浓度与hgps阳性对照进行比较，其中样品中的早衰蛋白浓度低于hgps阳性对照中的早衰蛋白浓度，表明对象的期望寿命增加。

2、在所述方法的特定实施方案中，样品是选自血浆、血清、尿液和唾液的液体样品。

3、在其他特定的实施方案中，用于所述方法的定量免疫分析包括以下步骤：使既与野生型核纤层蛋白a结合又与早衰蛋白结合的捕获抗体与样品接触，产生捕获的核纤层蛋白a和捕获的早衰蛋白的混合物；将捕获的核纤层蛋白a和捕获的早衰蛋白的混合物与样品分离；使捕获的核纤层蛋白a和捕获的早衰蛋白的混合物与包含可检测标记的早衰蛋白特异性检测抗体接触，从而使检测抗体与捕获的早衰蛋白结合，但不与捕获的核纤层蛋白a结合；将可检测标记与具有捕获的核纤层蛋白a的混合物分离；和检测可检测标记，从而定量样品中的早衰蛋白的量。

4、在所述方法的特定实施方案中，对照来自较早时间点的相同对象。

5、在一些实施方案中，定量免疫分析的定量下限为59pg/ml。在其他实施方案中，定量免疫分析的定量上限为30000pg/ml。在另一些实施方案中，定量免疫分析的定量范围为59pg/ml至30000pg/ml。

6、在某些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：在对象经受用于hgps的治疗后，重复该方法一次或多于一次，其中治疗后早衰蛋白浓度降低、进一步降低或保持降低表明期望寿命增加。

7、在特定的实施方案中，早衰蛋白浓度的降低为35％至62％。

8、在另一些实施方案中，早衰蛋白浓度的降低越大，表明期望寿命的增加越大。

9、本文还描述了用于确定用于哈钦森-吉尔福德早衰综合征(hgps)的治疗的疗效的方法，该方法包括以下步骤：提供来自对象的治疗前样品，其是在施用用于hgps的治疗之前采集的；用定量免疫分析确定治疗前样品中的早衰蛋白浓度，其中定量免疫分析检测早衰蛋白，但不检测野生型核纤层蛋白a蛋白；提供来自对象的治疗后样品，其是在施用用于hgps的治疗期间或施用用于hgps的治疗之后采集的；用定量免疫分析确定治疗后样品中的早衰蛋白浓度；和将治疗前的早衰蛋白浓度与治疗后的早衰蛋白浓度进行比较，其中治疗后样品中的早衰蛋白浓度的显著降低表明治疗有效。

10、在特定的实施方案中，治疗前样品和治疗后样品是选自血浆、血清、尿液和唾液的液体样品。

11、在其他实施方案中，该方法还包括提供一个或多于一个附加的治疗后样品，其是在最初的治疗后样品之后的时间点从对象采集的，其中早衰蛋白浓度持续降低或进一步降低表明有持续的治疗疗效。

12、在特定的实施方案中，定量免疫分析包括以下步骤：使既与野生型核纤层蛋白a结合又与早衰蛋白结合的捕获抗体与样品接触，产生捕获的核纤层蛋白a和捕获的早衰蛋白的混合物；将捕获的核纤层蛋白a和捕获的早衰蛋白的混合物与样品分离；使捕获的核纤层蛋白a和捕获的早衰蛋白的混合物与包含可检测标记的早衰蛋白特异性检测抗体接触，从而使检测抗体与捕获的早衰蛋白结合，但不与捕获的核纤层蛋白a结合；将可检测标记与具有捕获的核纤层蛋白a的混合物分离；和检测可检测标记，从而定量样品中的早衰蛋白的量。

13、在一些实施方案中，定量免疫分析的定量下限为59pg/ml。在其他实施方案中，定量免疫分析的定量上限为30000pg/ml。在另一些实施方案中，定量免疫分析的定量范围为59pg/ml至30000pg/ml。

14、在所述方法的特定实施方案中，用于hgps的治疗包括法尼基转移酶抑制剂，其在特定实施方案中为洛那法尼。

15、本文还描述了用于对象中哈钦森-吉尔福德早衰综合征(hgps)的治疗的方法，该方法包括以下步骤：提供来自对象的样品；用定量免疫分析对样品中的早衰蛋白浓度进行定量，其中定量免疫分析检测早衰蛋白，但不检测野生型核纤层蛋白a蛋白；将样品中的早衰蛋白浓度与hgps阳性对照进行比较，其中如果样品中的早衰蛋白浓度表明对象患有hgps；和如果对象患有hgps，向对象施用降低早衰蛋白浓度的用于hgps的治疗。

16、在一些实施方案中，定量免疫分析的定量下限为59pg/ml。在其他实施方案中，定量免疫分析的定量上限为30000pg/ml。在另一些实施方案中，定量免疫分析的定量范围为59pg/ml至30000pg/ml。

17、在所述方法的特定实施方案中，用于hgps的治疗包括法尼基转移酶抑制剂，其在特定实施方案中为洛那法尼。

18、上述及其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得更加明显。