一种CuxS/多价DNA支架-磁珠偶合物及其光热可视化检测黄曲霉毒素B1的应用

本发明属于黄曲霉毒素检测，具体涉及一种基于多价dna支架和cuxsnps光热可视化检测黄曲霉毒素b1的cuxs/多价dna支架-磁珠偶合物，以及检测方法。

背景技术：

1、近年来，食品安全问题严重威胁着人们的生命安全。黄曲霉毒素是一类由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的有毒次生代谢产物，在食品及食品原料中广泛存在，给人类和动物的健康造成了严重的威胁。黄曲霉毒素主要包括黄曲霉毒素b1、黄曲霉毒素b2、黄曲霉毒素g1、黄曲霉毒素g2四种化合物，其中以黄曲霉毒素b1占比最大(约占70％)、毒性最强(其毒性是砒霜的68倍，是氰化钾的10倍)。因此，建立便捷有效的黄曲霉毒素b1的检测方法，对预防食品安全事件的发生以及保障人类的身体健康具有重大意义。

2、传统的黄曲霉毒素b1检测方法有高效液相色谱法、气相色谱法、液相色谱-质谱联用法等，这些检测技术目前已经比较成熟，且检测的精确度和准确度都比较高。但是存在操作繁琐、分析周期长、成本高、需要复杂的样品预处理等问题，只适用于实验室小批量样品的精确检测，无法满足生产实践中大量样品的现场快速筛查。因此，开发可视化、便捷、廉价的黄曲霉毒素b1检测方法，能够为食品规模生产和加工过程中的安全控制提供有效的方法和手段支撑。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服上述现有技术中的不足，提供一种基于多价dna支架和cuxsnps光热可视化检测黄曲霉毒素b1的cuxs/多价dna支架-磁珠偶合物。

2、本发明提供的cuxs/多价dna支架-磁珠偶合物是：将生物素化适配体和cuxs-cdna探针通过碱基互补配对作用形成cuxs/多价dna支架，适配体-磁珠偶联物上的适配体将所述支架捕获至磁珠表面，形成cuxs/多价dna支架-磁珠偶合物。其中，所述cuxs-cdna探针是将巯基化cdna用三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐还原二硫键后与cuxs纳米颗粒通过cu-s键结合形成；所述适配体-磁珠偶联物是将链霉亲和素修饰的磁珠与生物素化适配体通过生物素-亲和素的高亲和作用形成。

3、上述生物素化适配体的核苷酸序列为：biotin-acacccggatcgcttcccgtgctctgtgtctctctgttgtgcacgggttg。

4、上述巯基化cdna的核苷酸序列为：sh-ttttttagacacagagcacgggaacaacccgtgcacaacagag。

5、本发明cuxs/多价dna支架-磁珠偶合物的制备方法为：将含生物素化适配体的tris-hcl缓冲液、cuxs-cdna探针分散液、适配体-磁珠偶联物分散液等体积混合，室温振荡孵育后用tris-hcl缓冲液磁选洗涤，得到cuxs/多价dna支架-磁珠偶合物，将其分散于tris-hcl缓冲液中保存。其中，优选所述含生物素化适配体的tris-hcl缓冲液中生物素化适配体浓度为0.5～1.5μm，所述cuxs-cdna探针分散液中cdna浓度为0.5～1.5μm，所述适配体-磁珠偶联物分散液中磁珠浓度为1～2mg/ml。

6、上述cuxs-cdna探针分散液的制备方法为：将巯基化cdna与2.0mm三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐的水溶液混合20～40min，然后将所得混合液滴入cuxs纳米颗粒分散液中，黑暗条件下孵育6～8h，使巯基化cdna与cuxs通过cu-s键结合；最后，将混合液离心分离，所得沉淀分散于tris-hcl缓冲液中，得到cuxs-cdna探针分散液。其中，优选所述巯基化cdna与cuxs纳米颗粒的加料配比为1nmol:0.05～0.1mg，所述cuxs纳米颗粒分散液是将cuxs纳米颗粒分散于超纯水中制成，其中cuxs纳米颗粒的浓度为0.05～0.1mg/ml。

7、上述适配体-磁珠偶联物分散液的制备方法为：将链霉亲和素修饰的磁珠分散液与含生物素化适配体的tris-hcl缓冲液等体积混合，充分混匀后室温孵育20～40min，然后用tris-hcl缓冲液磁选洗涤，所得沉淀分散于tris-hcl缓冲液，得到适配体-磁珠偶联物分散液。其中，所述链霉亲和素修饰的磁珠分散液是将链霉亲和素修饰的磁珠分散于超纯水中制成，其中链霉亲和素修饰的磁珠的浓度为1～2mg/ml，所述含生物素化适配体的tris-hcl缓冲液中生物素化适配体的浓度为400～600nm。

8、本发明还提供了上述cuxs/多价dna支架-磁珠偶合物在光热可视化检测黄曲霉毒素b1(afb1)中的用途，具体检测方法包括下述步骤：

9、步骤1：将cuxs/多价dna支架-磁珠偶合物分散于tris-hcl缓冲液中，形成cuxs/多价dna支架-磁珠偶合物分散液；向cuxs/多价dna支架-磁珠偶合物分散液中加入不同浓度的黄曲霉毒素b1水溶液，室温孵育40～60min，磁分离取上清液，将上清液置于808nm激光下照射2～3min，用便携式光热成像仪对其进行红外成像并记录照射前后温度变化，以黄曲霉毒素b1的浓度为横坐标，上清液的温度变化量为纵坐标绘制出标准曲线。

10、步骤2：向cuxs/多价dna支架-磁珠偶合物分散液中加入待测样品，室温孵育40～60min，磁分离取上清液，将上清液置于808nm激光下照射2～3min，用便携式光热成像仪对其进行红外成像并记录照射前后温度变化量，结合步骤1的标准曲线确定待测样品中黄曲霉毒素b1的浓度。

11、进一步，优选上述cuxs/多价dna支架-磁珠偶合物分散液以磁珠质量浓度计浓度为0.5～1mg/ml。

12、本发明的有益效果如下：

13、(1)本发明的cuxs/多价dna支架-磁珠偶合物可通过肉眼直接检测小分子危害物黄曲霉毒素b1，无需复杂的精密仪器仅用温度计即可目标物精确定量。

14、(2)本发明的cuxs/多价dna支架-磁珠偶合物中多价dna支架提高了黄曲霉毒素b1分析灵敏度和分析效率。

15、(3)本发明的cuxs/多价dna支架-磁珠偶合物在检测小分子黄曲霉毒素b1中特异性好、成本低、方便快捷。

16、(4)本发明的cuxs/多价dna支架-磁珠偶合物在检测小分子危害物黄曲霉毒素b1时，2～3min即可输出可视及定量信号。

技术特征：

1.一种cuxs/多价dna支架-磁珠偶合物，其特征在于，将生物素化适配体和cuxs-cdna探针通过碱基互补配对作用形成cuxs/多价dna支架，适配体-磁珠偶联物上的适配体将所述支架捕获至磁珠表面，形成cuxs/多价dna支架-磁珠偶合物；

2.根据权利要求1所述的cuxs/多价dna支架-磁珠偶合物，其特征在于，所述cuxs/多价dna支架-磁珠偶合物由下述方法制备得到：将含生物素化适配体的tris-hcl缓冲液、cuxs-cdna探针分散液、适配体-磁珠偶联物分散液等体积混合，室温振荡孵育后用tris-hcl缓冲液磁选洗涤，得到cuxs/多价dna支架-磁珠偶合物，将其分散于tris-hcl缓冲液中保存。

3.根据权利要求2所述的cuxs/多价dna支架-磁珠偶合物，其特征在于，所述含生物素化适配体的tris-hcl缓冲液中生物素化适配体浓度为0.5～1.5μm，所述cuxs-cdna探针分散液中cdna浓度为0.5～1.5μm，所述适配体-磁珠偶联物分散液中磁珠浓度为1～2mg/ml。

4.根据权利要求2或3所述的cuxs/多价dna支架-磁珠偶合物，其特征在于，所述cuxs-cdna探针分散液的制备方法为：将巯基化cdna与2.0mm三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐的水溶液混合20～40min，然后将所得混合液滴入cuxs纳米颗粒分散液中，黑暗条件下孵育6～8h，使巯基化cdna与cuxs通过cu-s键结合；最后，将混合液离心分离，所得沉淀分散于tris-hcl缓冲液中，得到cuxs-cdna探针分散液。

5.根据权利要求4所述的cuxs/多价dna支架-磁珠偶合物，其特征在于，所述cuxs-cdna探针分散液的制备方法中，所述巯基化cdna与cuxs纳米颗粒的加料配比为1nmol:0.05～0.1mg，所述cuxs纳米颗粒分散液是将cuxs纳米颗粒分散于超纯水中制成，其中cuxs纳米颗粒的浓度为0.05～0.1mg/ml。

6.根据权利要求2或3所述的cuxs/多价dna支架-磁珠偶合物，其特征在于，所述适配体-磁珠偶联物分散液的制备方法为：将链霉亲和素修饰的磁珠分散液与含生物素化适配体的tris-hcl缓冲液等体积混合，充分混匀后室温孵育20～40min，然后用tris-hcl缓冲液磁选洗涤，所得沉淀分散于tris-hcl缓冲液，得到适配体-磁珠偶联物分散液。

7.根据权利要求6所述的cuxs/多价dna支架-磁珠偶合物，其特征在于，所述适配体-磁珠偶联物分散液的制备方法中，所述链霉亲和素修饰的磁珠分散液是将链霉亲和素修饰的磁珠分散于超纯水中制成，其中链霉亲和素修饰的磁珠的浓度为1～2mg/ml，所述含生物素化适配体的tris-hcl缓冲液中生物素化适配体的浓度为400～600nm。

8.权利要求1所述的cuxs/多价dna支架-磁珠偶合物在光热可视化检测黄曲霉毒素b1中的用途。

9.根据权利要求8所述的cuxs/多价dna支架-磁珠偶合物在光热可视化检测黄曲霉毒素b1中的用途，其特征在于，具体检测方法包括下述步骤：

10.根据权利要求9所述的cuxs/多价dna支架-磁珠偶合物在光热可视化检测黄曲霉毒素b1中的用途，其特征在于，所述cuxs/多价dna支架-磁珠偶合物分散液以磁珠质量浓度计浓度为0.5～1mg/ml。

技术总结本发明公开了一种CuxS/多价DNA支架‑磁珠偶合物及其光热可视化检测黄曲霉毒素B1的应用。将CuxS NPs通过Cu‑S键修饰在巯基化cDNA上，形成CuxS‑cDNA探针，多个CuxS‑cDNA探针与多个生物素化适配体通过首尾碱基互补配对作用形成CuxS/多价DNA支架，并通过适配体上的生物素与亲和素之间的高亲和力，包覆于亲和素化磁珠的表面，形成CuxS/多价DNA支架‑磁珠偶合物。当黄曲霉毒素B1(AFB1)存在时，AFB1与适配体特异性结合，CuxS/多价DNA支架部分瓦解，释放出CuxS‑cDNA探针，经磁分离后，包含CuxS‑cDNA探针的上清液在近红外光照射下温度升高，展现出光热性能，可根据上清液在激光照射前后的温度变化与AFB1含量建立定量关系，利用便携式热成像仪或温度计实现AFB1的可视化定量检测。技术研发人员：刘梅,和紫阳受保护的技术使用者：陕西师范大学技术研发日：技术公布日：2024/8/27