一种猪繁殖与呼吸综合征病毒生产用细胞系

本发明属于生物工程，涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒生产用细胞系。

背景技术：

1、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome，prrsv)属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，该病毒主要引起猪繁殖与呼吸综合征，临床表现为怀孕母猪早产，流产，产木乃伊胎、弱胎、死胎等，成年猪主要多发呼吸道症状，新生仔猪成活率下降。该病在全球范围内迅速蔓延，给养猪业造成了巨大的经济损失。

2、prrsv基因组大小约为15.4kb，包含10个开放阅读框。其中orf1a和orf1b编码的多聚蛋白经过蛋白酶裂解后可以生成14个非结构蛋白，分别为nsp1α、nsp1β、nsp2、nsp3、nsp4、nsp5、nsp6、nsp7α、nsp7β、nsp8、nsp9、nsp10、nsp11和nsp12(y.fang,e.j.snijder,the prrsv replicase:exploring the multifunctionality of an intriguing set ofnonstructural proteins.virus res.154,61(2010))，orf2a、orf2b、orf3、orf4、orf5a、orf5～orf7分别编码结构蛋白gp2a、2b(e)、gp3、gp4、orf5a、gp5、囊膜蛋白m及衣壳蛋白n蛋白。

3、非结构蛋白在病毒的复制过程中发挥着主要作用，通过形成复制和转录复合物进行病毒的基因组的合成、转录和翻译等。与此同时非结构蛋白通过多种其它途径促进病毒的复制，其中，nsp1α、nsp1β、nsp2、nsp4、nsp5、nsp6、nsp10和nsp11可以通过多种途径来抑制宿主天然免疫应答，抑制抗病毒相关基因的激活及转录，尤其是干扰ⅰ型ifn的产生，从而促进病毒的复制。其中，nsp1β、nsp2及nsp10可以通过抑制irf-3及nf-κb来抑制干扰素的产生，nsp1α通过降解cbp抑制ifn的产生，nsp4通过阻断nf-κb的激活抑制ifn的产生(ke w,zhou y,lai y,long s,fang l,xiao s.porcine reproductive and respiratorysyndrome virus nsp4 positively regulates cellular cholesterol to inhibit typei interferon production.redox biol.2022feb；49:102207.)，nsp5促进stat3的降解，干扰jak/stat3信号，nsp6通过泛素化蛋白酶解malt1抑制ifn-β的产生。nsp6可以通过其泛素化共同通过蛋白酶降解途径介导malt1的降解，进而抑制nf-κb信号通路，抑制ifn、il-1β及il-6的产生促进病毒的复制。(gu h,zheng s,han g,yang h,deng z,liu z,he f.porcinereproductive and respiratory syndrome virus adapts antiviral innate immunityvia manipulating malt1.mbio.2022jun28；13(3):e0066422.doi:10.1128/mbio.00664-22.epub 2022apr 25.pmid:35467421；pmcid:pmc9239189.)。nsp11具有尿苷酸特异性核糖核酸内切酶(nendou)活性，抑制irf3，抑制ⅰ型干扰素产生，抑制erk信号通路抑制tnf-α影响il-17的产生，间接影响宿主天然免疫系统。nsp8是一种rna依赖的聚合酶，属于nsp9n端结构域(liu y,hu y,chai y,liu l,song j,zhou s,su j,zhou l,ge x,guo x,han j,yang h.identification of nonstructural protein 8as the n-terminus of the rna-dependent rna polymerase of porcine reproductive and respiratory syndromevirus.virol sin.2018oct；33(5):429-439.)，但是单独表达nsp8对病毒复制是否产生影响没有相关报道。nsp12可以与其它nsps进行互作形成复制和转录复合物进行基因组的合成，进行病毒亚基因组mrna的合成(the nsp12-coding region of type 2prrsv isrequired for viral subgenomic mrna synthesis)。

4、表1prrsv非结构蛋白的结构及功能

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7、marc145细胞是目前唯一用来进行prrsv传代致弱的细胞系，有研究发现在marc145上过表达病毒蛋白nsp2可以显著提高病毒滴度，但是nsp2与orf3及orf5一样具有高度变异的特性，且极易在毒株间发生自然重组，因此，选择相对或高度保守的基因蛋白进行稳定表达，可以保证种毒基因的遗传稳定性，另外，过表达的基因不影响病毒传代致弱的过程尤为重要。也有在marc145上过表达猪源cd163、cd151和cd169等受体，可以将病毒滴度提高2～5倍，但由于引入了猪源的基因序列，在一定程度上改变了marc145细胞的生物学特性，并且这些受体基因序列较大增加了构建的难度。目前有研究人员通过对不同代次毒株(f1～f112)的氨基酸序列进行监测，发现prrsv的19个蛋白中的nsp6和nsp8蛋白高度保守，这两个蛋白几乎不发生任何突变，其次n蛋白、nsp4及nsp12蛋白也相对保守，说明这几个蛋白对毒株的致弱没有影响(an tq,tian zj,zhou yj,xiao y,peng jm,chen j,jiang yf,hao xf,tong gz.comparative genomic analysis of five pairs of virulentparental/attenuated vaccine strains of prrsv.vet microbiol.2011apr 21；149(1-2):104-12.)。通过比对发现nsp6和nsp8在ⅱ型prrsv毒株间的氨基酸序列也是高度保守的，nsp4及nsp12则相对保守。这几个蛋白都较小，其中nsp6是最小的蛋白仅16个氨基酸，nsp8为45aa、nsp12为153个氨基酸，nsp4为204个氨基酸，过表达后对细胞的生物学特性的影响相对较小。拟希望通过构建单独或联合表达这几种复制相关的非结构蛋白(nsp4、nsp6、nsp8和nsp12)的marc145细胞株提高病毒产量，并且不会导致病毒与过表达的外源基因发生重组，另外由于这几个基因较保守不会对病毒传代致弱的过程造成任何干扰，构建的稳定表达细胞系可以用来作为弱毒疫苗的的生产用细胞系，生产更高效价的疫苗。

8、目前已有多种共表达元件可以实现多基因共表达，其中ires最早发现于病毒基因组，如昆虫病毒和哺乳动物病毒。后来在一些真核生物基因组中也发现了类似的序列。ires是一段具有特殊结构的rna序列，能够折叠成类似起始trna的结构，直接结合核糖体而不依赖5’端帽子结构，独立翻译除翻译起始位点以外的mrna序列，从而实现多个基因在同一mrna上独立翻译。2a肽最早发现于足口病毒(foot-and-mouth disease virus,fmdv)的2a基因。2a肽是一段短肽序列，通常由18-22个氨基酸组成。在翻译过程中，2a肽的c端与n端之间不会形成肽键，从而实现蛋白质的自我剪切。即通过将2a肽序列插入到两个基因之间，可以使得翻译过程中蛋白质自动剪切，从而实现多个蛋白质的独立表达。目前常用的2a肽有四种：p2a、t2a、e2a和f2a。p2a最早发现的2a肽之一，由19个氨基酸组成，剪切效率最高；t2a由18个氨基酸组成，剪切效率较p2a次之；e2a由20个氨基酸组成，剪切效率较低；f2a由22个氨基酸组成，剪切效率也较低。

9、慢病毒构建稳转细胞系的原理主要是利用慢病毒载体将外源基因导入宿主细胞，并实现外源基因的稳定表达。当慢病毒载体被导入宿主细胞后，它可以利用细胞的复制和转录机制将外源基因插入宿主细胞和染色体中，从而实现外源基因的稳定表达。慢病毒可以高效地将外源基因转移到各种类型的细胞中，宿主范围广，并且可以在宿主细胞中稳定复制和表达。marc145细胞转染效率较低，且转染试剂费用较昂贵。因此，先择慢病毒构建稳转细胞系可以快速高效地筛选出稳定表达外源基因的稳转细胞系。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的第一目的是提供了一种包括猪繁殖于呼吸综合征病毒重组基因片段的重组载体。本发明的第二目的是提供一种含有上述重组载体的重组慢病毒。本发明的第三目的是提供上述重组载体及重组慢病毒的构建方法。本发明的第四目的是提供一种用于提高猪繁殖于呼吸综合征病毒或弱毒疫苗生产效价用的细胞系。

2、技术方案：本发明的一种重组载体，所述重组载体包括病毒基因片段，重组病毒基因片段具体包括prrsv js2021nadc34毒株的nsp4基因、nsp6基因、nsp12基因，以及ires基因和p2a基因；分别包括nsp4、ires-nsp6和p2a-nsp123段基因片段，所述的nsp4基因片段的核苷酸序列如seq id no.7所示，ires-nsp6基因片段的核苷酸序列如seq id no.8所示，p2a-nsp12基因片段的核苷酸序列如seq id no.9所示。

3、具体地，上述nsp4基因是位于js2021nadc34的基因组(genbank登录号：mz820388.1)的第5316-5927位(共计612bp)，nsp6基因是位于js2021nadc34的基因组的第6438-6485位(共计51bp)，nsp12基因是位于js2021nadc34的基因组的第11,309-11,767位(共计462bp)，ires序列来自自建质粒puc19-ires-egfp(本实验室构建和保存)(共计574bp)，p2a基因序列参考cloning vector px602-bdd-f8(genbank登录号：mn548087.1)(共计57bp)。

4、进一步地，上述所述的重组目的基因的核苷酸序列如seq id no:11所示。

5、本发明的重组慢病毒，含上述的重组载体。

6、本发明的重组载体的构建方法，包括以下步骤：

7、(1)分别扩增nsp4、ires-nsp6和p2a-nsp12 3段基因片段；

8、(2)将上述3段基因片段同时插入表达载体，得到最终重组表达载体。

9、进一步地，步骤(1)中所述的nsp4基因片段的核苷酸序列如seq id no.7所示，ires-nsp6基因片段的核苷酸序列如seq id no.8所示，p2a-nsp12基因片段的核苷酸序列如seq id no.9所示。

10、进一步地，步骤(2)所述表达载体为cn179 plov-cmv-egfp-ef1a-puror载体。

11、进一步地，步骤(2)中扩增nsp4基因所用引物序列如seq id no:1～2所示，扩增ires-nsp6基因所用引物序列如seq id no:3～4所示，扩增p2a-nsp12基因所用引物序列如seq id no:5～6所示。

12、本发明的重组慢毒株的构建方法，将上述重组载体转染至293t细胞，并通过过滤、浓缩培养上清获得病毒滴度≥106.0tcid50/0.1ml的重组慢病毒。

13、本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒生产用细胞系，用上述重组慢病毒感染marc145细胞即得。

14、具体的，用上述重组慢病毒感染marc145细胞，经过嘌呤霉素筛选，即可获得稳定表达nsp4、nsp6及nsp12的marc145细胞系。

15、进一步地，所述重组慢病毒感染marc145细胞后的细胞株培养的猪繁殖与呼吸综合征重组毒株的病毒含量≥108.5tcid50/ml。有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：本发明的重组慢病毒显著提高了prrsv在marc145细胞上的复制效率，接毒24h后病毒的tcid50可达到108.0tcid50/0.1ml以上，大大提高了生产效率，缩短了生产时间和生产成本。本发明的marc145细胞以病毒本身高度保守的非结构蛋白为外源蛋白，对于病毒的传代致弱没有任何影响，亦可用于弱毒疫苗的制备，不存在毒株重组毒力返强的风险。