大麦HvNOP58基因启动子及其应用

本发明涉及大麦hvnop58基因启动子领域，特别涉及大麦hvnop58基因启动子及其应用。

背景技术：

1、启动子是基因表达调控的关键因子，主要包括核心启动和上游顺式元件。核心启动子可被rna聚合酶识别、结合，是基因转录的必要元件。上游顺式元件可与不同反式因子(蛋白质)结合，通过所结合的反式因子与rna聚合酶的互作调控基因表达的时空模式，进而调节基因在生物发育、细胞周期调控和衰老机制等生物进程的作用。

2、基于所克隆启动子构建植物转基因、基因功能验证和基因编辑等研究所需的适宜表达载体也成为生物技术产业主要商业化产品。到目前为止，大麦转基因、基因功能验证和基因编辑等研究大多采用水稻、小麦和花椰菜花叶病毒等生物的组成型启动子，少有基于大麦启动子构建的表达载体、特别是可诱导的商业化表达载体的报道。基于水稻、小麦和花椰菜花叶病毒等生物的组成型启动子构建的表达载体可造成转基因植株的极大能量浪费、扰乱受体基因的特表特性和遗传平衡，难以提供较准确性的基因功能信息、降低基因编辑效率，而且大麦遗传背景对其具有一定的负面影响。

3、到目前为止，已报道的植物核仁蛋白700多个核仁蛋白质，其中大多数核仁蛋白参与核糖体的合成与加工，而另外一些核仁蛋白则参与端粒代谢、细胞周期调控、细胞衰老等活动，进而影响植物生长发育。拟南芥编码核仁蛋白atnuc-l1突变物株生长缓慢、新叶不规则皱缩、种子数量减少及细胞核仁紊乱。拟南芥突变体rid1-1在高温条件下表现下胚轴和分生组织缺陷，rid1-2和rid1-3植物的成熟角果比野生型的短。虽然已报道了大量的植物核仁蛋白及其生物功能，但未见大麦hvnop58基因及其启动子结构与功能的研究报道。

4、利用ems(ethylmethylsulfone)诱变北青7号成熟种子，结合自交繁殖技术，项目组创制裸大麦ynbs(yunnanbranched spike)突变体。并进行了ynbs突变体的穗分枝、多小穗数、退化小穗数等4个穗部性状关联遗传分析。基于ynbs突变体与保大麦杂交的f2、f6群体，项目组定位了大穗分枝、多联小穗数、退化小穗数和小穗小花数等性状的基因位点，并发现4个性状的基因位点高度连锁、均位于分子标记hvssr4与hvssr20间。在hvssr4与hvssr20标记界定的morex参考基因组序列中注解到horvu.morex.r3.2hg0114930基因。该基因具有核仁蛋白的n端结构域、nosic结构域和nop结构域，其编码蛋白与水稻、拟南芥和人等13种生物体核仁蛋白同源，编码蛋白的氨基酸序列与乌拉尔图小麦、普通小麦和黑麦核仁蛋白的相同氨基酸比例分别达到了84.56％、85.02％、80.97％。因此，将该基因暂时命名为hvnop58。

5、为了hvnop58基因的遗传功能、表达特性和转录调控机制，本项目鉴定了hvnop58基因启动子、设计并验证了hvnop58基因启动子及其3个截断片段的特异性扩增引物、克隆了该启动及其截断片段。牟少亮等利用oserf96启动子驱动gus的转基因水稻株系分析了oserf96启动子的诱导活性，发现gus水稻转基因植株的根、茎和叶中均有不同程度组成型表达，并且稻瘟病菌接种后4～7d gus活性持续升高，oserf96启动子是一个对病原菌侵染产生应答的诱导性启动子。刘利伟等利用所设计引物，扩增并克隆了麻风树jcgasa6基因启动子序列,并对启动子进行5′端缺失克隆，将不同长度启动子截断片段克隆入以gus基因为报告基因的载体,进行本氏烟草瞬时转化，发现jcgasa6启动子的核心元件位置处于-473～-130bp之间。水稻和玉米ubiquitin基因的ubi启动子是一类强启动子，随着crispr/cas9基因编辑系统的开发，靶向结合目的基因位点的sgrna，需要转录活性较高的启动子来驱动，玉米和水稻的ubi启动子常常用于单子叶基因编辑载体以驱动sgrna表达。ma等开发了五种具有由ubi启动子或35s启动子启动子驱动的cas9基因的二元载体，该载体骨架以是广泛使用的pcambia1300载体，可用于应用于各种植物物种。到目前为止，该构建技术和体系也在水稻等植物基因编辑中广泛应用。

技术实现思路

1、为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供大麦hvnop58基因启动子及其应用。

2、为达到上述目的，本发明的技术方案为：

3、大麦hvnop58基因启动子，其中，goldenpromise、北青7号、morex和ynbs的hvnop58启动子序列分别如seq id no.1-4所示。

4、进一步的，进一步的，所述大麦hvnop58基因启动子克隆引物序列如seq id no.5-6所示：

5、m13f：gaggaaacagctatgac；

6、m13r：actggccgtcgttttac。

7、进一步的，所述启动子克隆的pcr反应体系具体为：

8、

9、大麦hvnop58基因启动子在构建大麦转基因、基因编辑和基因功能验证方面的应用。

10、相对于现有技术，本发明的有益效果为：

11、本发明以大麦hvnop58基因为参考序列，鉴定了morex参考基因组序列中该基因的启动子序列，克隆并验证了该基因启动子及其截断片段和顺式元件的活性，证明了温度、光照时间、生长素、茉莉酸和脱落酸可通过该启动子顺式元件调控基因表达，建立了该启动子序列检测技术体系。虽然也报道少了大麦基因的启动子，但大多为组成启动。基于这类启动子构建的表达载体可造成转基因植株的极大能量浪费、扰乱受体基因的特表特性和遗传平衡，难以提供较准确性的基因功能信息、降低基因编辑效率。到目前为止，大麦转基、基因编辑和基因功能验证等研究大多采用水稻、小麦和花椰菜花叶病毒等生物的组成型启动子，但大麦遗传背景对这些启动子的工作效率也具有负面影响。利用本发明克隆并验证的启动子及其截断片段可构建大麦转基因、基因编辑和基因功能验证等研究需要的表达载体、特别是受非生物因素诱导的表达载体。基于所构建的可诱导表达载体可提高大麦转基因的组织表达特性、减少目标基因过表达带来的遗传干扰，提高大麦基因功能验证的准确性和基因编辑效率，弥补现有商业载体的补助，进而提高大麦表达载体的商业价值。

技术特征：

1.大麦hvnop58基因启动子，其中，北青7号、goldenpromise、morex和ynbs的hvnop58启动子序列分别如seq id no.1-4所示。

2.根据权利要求1所述的大麦hvnop58基因启动子，其特征在于，所述大麦hvnop58基因启动子克隆引物序列如seq id no.5-6所示：

3.根据权利要求1所述的大麦hvnop58基因启动子，其特征在于，所述启动子克隆的pcr反应体系具体为：

4.权利要求1或2所述大麦hvnop58基因启动子在构建大麦转基因、基因编辑和基因功能验证方面的应用。

技术总结大麦HvNOP58基因启动子，其中，Goldenpromise、北青7号、Morex和Ynbs的HvNOP58启动子序列分别如SEQ ID No.1‑4所示。大麦HvNOP58基因启动子在构建大麦转基因、基因编辑和基因功能验证方面的应用。技术研发人员：陈升位,王梦玥,董陈文华,周鸿斌受保护的技术使用者：云南农业大学技术研发日：技术公布日：2024/8/27