特异性结合IL-8的抗体、抗体片段及其用途的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体涉及特异性结合il-8的抗体及其应用。

背景技术：

1、il-8分子量8.3kda，不成熟的il-8为99个氨基酸，单核细胞产生的成熟il-8分子主要形式为72个氨基酸，而内皮细胞产生的成熟il-8分子主要为77个氨基酸。主要介导细胞毒和局部炎症有关的免疫应答辅助抗体生成，参与细胞免疫及迟发型超敏型炎症的发生，主要生物学作用是趋化并激活中性粒细胞，促进中性粒细胞的溶酶体酶活性和吞噬作用。在α亚族中，il-8与groα、groβ、groγ、ena-78和nap-2相对有较高源性。il-8分子含4个cys，无n糖基化位点，耐热、耐碱，但对巯基化合物敏感。il-8的产生：il-1、tnf、lps和pha均能诱导单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞和表皮细胞等合成分泌il-8；pha等丝裂原活的t细胞也可产生il-8；人类多种肿瘤细胞均可高表达il-8。其中甲状腺癌、鳞状细胞癌、黑素瘤等可组成性产生il-8，而星状细胞瘤、肝癌、肾细胞癌等则需要il-1β或tnf-α等刺激下才合成和分泌il-8。

2、il-8是一种多功能因子，其生物学功能无种属特异性。早期发现中性粒细胞是其作用的靶细胞，能特异性趋化中性粒细胞进入炎性组织，促使其脱颗粒，产生超氧阴离子，引起呼吸暴发；并激活炎性细胞；促进急性期蛋白合成；引起发热、参与炎症病理性损害；促进炎性介质释放；促进成纤维细胞增殖－慢性炎症，所以在炎性反应中起重要作用。随着研究的深入，发现il-8能作用于不同细胞，它能促进炎性反应进程、刺激血管的形成、促有丝分裂、调节宿主免疫功能等，与多种炎性反应性疾病、肿瘤、免疫性疾病的发生和发展密切相关。(一)在炎症方面的应用在溃疡性结肠炎的应用与治疗上，溃疡性结肠炎使il-8的表达升高。炎症反应中的作用很大程度上是通过诱导il-8来介导完成的炎症引起的肿胀应用激素可以迅速缓解。在某些与中性粒细胞积聚有关炎症和呼吸系统疾病的局部或血清患者中il-8也有明显增高，如肺纤维化、呼吸窘迫综合征、慢性支气管炎、支气管扩张等il-8水平升高，在肺内均可趋化并激活中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞和嗜碱性粒细胞，从而造成炎症介质的过量释放，诱发炎症反应和组织损伤。高铝暴露使癫痫患者癫痫大发作，体内il-8的大量释放。(二)在肿瘤方面的临床应用抑制肿瘤细胞内的il-8信号可提高肿瘤细胞对常规化疗的敏感性。抑制肿瘤内的il-8信号传导可延缓肿瘤进程并可增加多种实体瘤对临床化疗的敏感度。(三)在过敏反应方面的应用国内外的一些研究均表明il-8在过敏性紫癜血管炎中有表达，对过敏性紫癜的发生、发展过程发挥一定的作用。il-8在过敏性紫癜患者血清中明显增高，治疗后下降明显，说明其在过敏性紫癜的发病中起到一定的作用。(四)在神经根型颈椎病治疗il-8是急性期反应的主要细胞因子介体，是对炎性刺激反应时由单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞释放的细胞因子。具有il-8、p物质对疼痛及炎症的敏感性较之crp更为敏感，常在crp升高以前，就可发现il-8、p物质升高。(五)在精神分裂症方面的治疗精神分裂症患者在治疗血清il-8水平非常显著地高于正常人，经抗精神病药物治疗6周后与正常人组比较仍有显著性差异。(六)醒脑静注射液对急性脑损伤患者il-8的影响醒脑静在促进意识恢复方面优于基础治疗。与治疗前比较，实验组治疗后il-8明显降低。

3、抗体(antibody)是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质。免疫球蛋白(不仅仅只是抗体)是一种由浆细胞(效应b细胞)分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型y形蛋白质，仅发现存在于脊椎动物的血液等体液中，及其b细胞的细胞膜表面。抗体通常使用免疫动物的b细胞制备，通过融合永生细胞系形成分泌所需抗体克隆的杂交瘤细胞。该杂交瘤技术可大量生产一致性高、特异性强、灵敏度高的抗体。然而，随着时间的推移，杂交瘤细胞系会出现遗传漂变，导致抗体出现微小差异。抗体可以和抗原特异性结合，可利用此原理从复杂成分中分离出特异性的抗体。抗体作为研究工具，可以用于生物标志物的发现和研究，也可以作为机体内蛋白互相作用、蛋白与核酸互相作用的研究工具。抗体具有多种应用。例如一些与相应的蛋白、核酸、酶等生物大分子特异性结合的抗体，标记上荧光标记或者化学发光标记后，能详尽的这些大分子在细胞中的位置、分布、表达量等情况。抗体的应用领域还包括免疫组化(ihc)、免疫荧光(if)、免疫印迹(westernblot)、酶联免疫吸附(elisa)等。抗体可以作为免疫抑制剂或者治疗药物，还可以作为医学检测或者检验试剂使用。单抗灵敏度高、特异性好，使其在鉴别菌种的型及亚型、病毒变异株，以及寄生虫不同生活周期的抗原性等方面更具独特优势。目前，抗体产品已经延伸到兽医检测检疫，食品安全检测、药物残留、致病微生物等领域。

4、杂交瘤抗体筛选技术为筛选具有靶点特异性且高亲和力的抗体提供了平台。该技术主要将能分泌抗体但不能无限增殖的浆b细胞与能在体外增殖且长期培养的骨髓瘤细胞相融合，筛选得到既能分泌特异性抗体且能长期培养无限增殖的杂交瘤细胞。并通过该杂交瘤的扩大培养实现抗体的生产制备，还可以通过液氮冷冻保存杂交瘤细胞，为后期抗体生产提供了便利。

5、需要对il-8具有更高亲和力的抗体，以治疗人类il-8介导的相关疾病。

技术实现思路

1、有鉴于此，发明人通过抗原免疫、杂交瘤筛选、抗体表达纯化到生物活性鉴定，筛选到2个具有全新cdr序列的抗人il-8抗体。与已知的抗人il-8抗体相比，该抗体对于与已知抗人il-8抗体相比，具有更高的灵敏度和特异性，可用于il-8的检测，并可用于人类il-8相关疾病的诊断、治疗和预防。

2、根据本发明的一个方面，提供了一种特异性结合il-8的抗体，所述抗体的重链可变区hcdr1、hcdr2、hcdr3和轻链可变区的lcdr1、lcdr2和lcdr3选自如下组合之一：

3、1)hcdr1的序列如seq id no：1所示；

4、hcdr2的序列如seq id no：2所示；

5、hcdr3的序列如seq id no：3所示；

6、lcdr1的序列如seq id no：4所示；

7、lcdr2的序列如seq id no：5所示；

8、lcdr3的序列如seq id no：6所示；或者

9、2)hcdr1的序列如seq id no：7所示；

10、hcdr2的序列如seq id no：8所示；

11、hcdr3的序列如seq id no：9所示；

12、lcdr1的序列如seq id no：10所示；

13、lcdr2的序列如seq id no：11所示；

14、lcdr3的序列如seq id no：12所示。

15、所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:13所示，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:14所示；或者所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:15所示，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:16所示。

16、根据本发明的另一个方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白包括：(i)所述抗体；以及(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

17、根据本发明的另一个方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：(1)所述的抗体；或(2)所述的重组蛋白。优选地，所述多核苷酸的重链可变区的多核苷酸序列如seq id no:17所示，轻链可变区的多核苷酸序列如seq id no:18所示；或者所述抗体的重链可变区的多核苷酸序列如seq id no:19所示，轻链可变区的多核苷酸序列如seq id no:20所示

18、根据本发明的另一个方面，提供了一种载体，所述载体含有所述多核苷酸。

19、根据本发明的另一个方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的载体或基因组中整合有所述多核苷酸。

20、根据本发明的另一个方面，提供了一种抗体偶联物，该抗体偶联物含有：(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如权利要求1或2所述的抗体；以及(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。

21、根据本发明的另一个方面，提供了一种免疫细胞，所述免疫细胞表达所述抗体。

22、根据本发明的另一个方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：(i)所述抗体、所述重组蛋白、所述多核苷酸、所述载体、所述宿主细胞、所述抗体偶联物、所述免疫细胞、或其组合；以及(ii)药学上可接受的载体。

23、根据本发明的另一个方面，提供了一种检测或测定人il-8的方法，所述方法包括使用所述抗体、所述重组蛋白、所述多核苷酸、所述载体、所述宿主细胞、所述抗体偶联物、所述免疫细胞或其组合；优选地，所述检测方法包括酶免疫分析法、酶联免疫吸附法、酶联免疫斑点法、免疫组织化学法、免疫荧光法、免疫印迹法和流式细胞分析。

24、本技术的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。