腺相关病毒载体递送肌肉特异性微肌营养不良蛋白以治疗肌营养不良症的制作方法

本发明提供基因治疗载体，例如腺相关病毒(aav)载体，其表达小型化的人微肌营养不良蛋白基因，以及使用这些载体在骨骼肌(包括膈肌和心肌)中表达微肌营养不良蛋白并保护肌纤维不受伤、增加肌肉力量和减少和/或防止患有肌营养不良的受试者的纤维化的方法。

背景技术：

1、肌肉量和力量对日常活动(如运动和呼吸)以及全身新陈代谢的重要性是明确的。肌肉功能缺陷会产生肌肉营养不良症(md)，其特点是肌肉无力和消瘦，对生活质量有严重影响。最充分表征的md是由编码肌营养不良蛋白相关蛋白复合物(dapc)成员的基因突变引起的。这些md是由与dapc的肌膜-细胞骨架束缚丧失相关的膜脆性引起的。duchenne肌营养不良症(dmd)是最具破坏性的肌肉疾病之一，影响5000名新生男性中的1名。

2、dmd由dmd基因突变引起，导致mrna减少和肌营养不良蛋白的缺失，肌营养不良蛋白是与肌营养不良蛋白相关蛋白复合物(dapc)相关的427kd肌膜蛋白(hoffman等人，cell51(6):919-28,1987)。dapc由肌肉肌膜上的多种蛋白质组成，通过肌营养不良蛋白(一种肌动蛋白结合蛋白)和α-肌营养不良蛋白聚糖(一种层粘连蛋白结合蛋白)在细胞外基质(ecm)和细胞骨架之间形成结构连接。这些结构连接用于在收缩期间稳定肌细胞膜并防止收缩引起的损伤。随着肌营养不良蛋白的丧失，膜脆性导致肌膜撕裂和钙的流入，引发钙激活的蛋白酶和节段性纤维坏死(straub等人，curr opin.neurol.10(2):168-75,1997)。这种不受控制的肌肉退化和再生循环最终会耗尽肌肉干细胞群(sacco等人，cell,2010.143(7):p.1059-71；wallace等人，annu rev physiol,2009.71:p.37-57)，导致进行性肌肉无力、肌内膜炎症和纤维化瘢痕形成。

3、如果没有肌营养不良蛋白或微肌营养不良蛋白的膜稳定作用，dmd将表现出不受控制的组织损伤和修复循环，最终通过结缔组织增殖用纤维化瘢痕组织代替丢失的肌纤维。纤维化的特征在于ecm基质蛋白的过量沉积，包括胶原蛋白和弹性蛋白。ecm蛋白主要由细胞因子如tgfβ产生，其由对应激和炎症有反应的活化的成纤维细胞释放。尽管dmd的主要病理特征是肌纤维变性和坏死，但纤维化作为病理后果具有相同的影响。纤维化组织的过度产生限制了肌肉再生并且有助于dmd患者的进行性肌肉无力。在一项研究中，初始dmd肌肉活检组织中纤维化的存在与10年随访时的不良运动结果高度相关(desguerre等人，jneuropathol exp neurol,2009.68(7):p.762-7)。这些结果表明纤维化是dmd肌肉功能障碍的主要原因，并强调在明显纤维化之前需要早期干预。

4、腺相关病毒(aav)是复制缺陷型细小病毒，其单链dna基因组长约4.7kb，包括145个核苷酸的反向末端重复(itr)。存在多种血清型aav。aav血清型的基因组的核苷酸序列是已知的。例如，aav血清型2(aav2)基因组的核苷酸序列在如由ruffing等人《普通病毒学杂志(j gen virol)》75:3385-3392(1994)校正的srivastava等人《病毒学杂志(j virol)》45:555-564(1983)中提出。作为另一例子，aav-1的完整基因组在genbank登录号nc_002077中提供；aav-3的完整基因组在genbank登录号nc_1829中提供；aav-4的完整基因组在genbank登录号nc_001829中提供；aav-5基因组在genbank登录号af085716中提供；aav-6的完整基因组在genbank登录号nc_00 1862中提供；至少部分aav-7和aav-8基因组分别在genbank登录号ax753246和ax753249中提供(也参见涉及aav-8的美国专利7,282,199和7,790,449)；aav-9基因组在gao等人，《病毒学期刊》，78:6381-6388(2004)中提供；aav-10基因组在《分子疗法(mol.ther.)》，13(1):67-76(2006)中提供；和aav-11基因组在《病毒学(virology)》，330(2):375-383(2004)中提供。

5、aavrh.74血清型的克隆描述于rodino-klapac.等人，journal of translationalmedicine 5,45(2007)。指导病毒dna复制(rep)、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列包含在itr中。三个aav启动子(其相对图谱位置命名为p5、p19和p40)驱动编码rep和cap基因的两个aav内部开放阅读框的表达。两个rep启动子(p5和p19)与单个aav内含子的差异剪接(例如在aav2核苷酸2107和2227处)结合导致从rep基因产生四种rep蛋白(rep 78、rep 68、rep52和rep 40)。rep蛋白具有多种酶特性，所述酶特性最终负责复制病毒基因组。cap基因由p40启动子表現，並且其编码三种衣壳蛋白vp1、vp2及vp3。替代性剪接及非共有翻译起始位点负责产生三种相关的衣壳蛋白。单一共有聚腺苷酸化位点位于aav基因组的图谱位置95处。aav的生命周期及遗传学在muzyczka,《当前微生物学及免疫学的话题(current topics in microbiology and immunology)》,158:97-129(1992)中评论。

6、aav独特的特征在于，其作为例如在基因治疗中将外源dna递送至细胞的载体具有吸引力。培养中细胞的aav感染是非细胞病变的，並且人类及其他动物的自然感染是沉默的及无症状的。而且，aav感染许多哺乳动物细胞，允许活体內靶向许多不同组织的可能性。而且，aav转导缓慢分裂和非分裂细胞，并且可以作为转录活性核附加体(染色体外元件)基本上持续这些细胞的寿命。aav原病毒基因组作为质粒中的克隆dna具有感染性，这使得重组基因组的构建成为可能。此外，由于指导aav复制、基因组衣壳化和整合的信号包含在aav基因组的itr中，因此部分或全部内部约4.3kb的基因组(编码复制和结构衣壳蛋白，rep-cap)可以用如含有启动子、感兴趣的dna和多腺苷酸化信号的基因盒等外源dna替代。rep蛋白和cap蛋白可以以反式提供。aav的另一个显著特征是其是极其稳定且强健的病毒。它易于承受用于灭活腺病毒的条件(56℃到65℃，持续数小时)，使aav的冷保存不太重要。甚至可以将aav冻干。最后，aav感染的细胞不耐受重复感染。

7、多项研究证明了肌肉中长期(>1.5年)重组aav介导的蛋白质表达。参见clark等人，hum gene ther,8:659-669(1997)；kessler等人，proc nat.acad sc.usa,93:14082-14087(1996)；和xiao等人，j virol,70:8098-8108(1996)。还参见chao等人，mol ther,2:619-623(2000)和chao等人，mol ther,4:217-222(2001)。此外，由于肌肉高度血管化，重组aav转导导致肌肉注射后在体循环中出现转基因产物，如在herzog等人，proc natl acadsci usa,94:5804-5809(1997)和murphy等人，proc natl acad sci usa,94:13921-13926(1997)中所述。此外，lewis等人，j virol,76:8769-8775(2002)证明骨骼肌纤维具有正确的抗体糖基化、折叠和分泌所必需的细胞因子，表明肌肉能够稳定表达分泌的蛋白质治疗剂。

8、患有dmd和其他肌营养不良症的患者的功能改善需要在疾病的早期阶段进行基因恢复。需要在患有dmd的患者中增加肌肉力量并防止肌肉损伤的治疗。

技术实现思路

1、本发明涉及基因治疗载体，例如aav，其将微肌营养不良蛋白基因表达至骨骼肌，包括膈肌和心肌，以保护肌纤维免受损伤、增加肌肉力量并减少和/或预防纤维化。

2、本发明提供了使用基因治疗载体递送微肌营养不良蛋白以解决在dmd中观察到的基因缺陷来增加肌肉力量和/或增加肌肉量的疗法和方法。如实施例2中所示，用微肌营养不良蛋白基因疗法治疗导致体内更大的肌肉力量。此外，肌内和全身递送微肌营养不良蛋白基因疗法显示体内小鼠模型中肌营养不良蛋白递送至肌肉。

3、在一个实施方案中，本发明提供了raav载体，其包含肌肉特异性控制元件核苷酸序列和编码微肌营养不良蛋白的核苷酸序列。例如，核苷酸序列编码功能性微肌营养不良蛋白，其中核苷酸与seq id no：1具有例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％，更通常至少90％、91％、92％、93％或94％，甚至更通常至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，其中所述蛋白质保留微肌营养不良蛋白活性。微肌营养不良蛋白在肌肉收缩期间为肌肉膜提供稳定性，例如微肌营养不良蛋白在肌肉收缩期间充当减震器。

4、本发明还提供了raav载体，其中核苷酸序列编码功能性微肌营养不良蛋白，其包含在严格条件下与seq id no：1的核酸序列或其互补物杂交并编码功能性微肌营养不良蛋白的核苷酸序列。

5、在一个实施方案中，raav载体是称为raavrh74.mhck7.微肌营养不良蛋白的非复制型重组腺相关病毒(aav)。该载体基因组含有基因表达所需的最小元件，包括aav2反向末端重复序列(itr)、微肌营养不良蛋白、sv40内含子(sd/sa)和合成多聚腺苷酸化(poly a)信号，均在mhck7启动子/增强子的控制下。载体基因组和表达盒的示意图显示在图1中。iv施用后，aavrh74血清型可用于在骨骼肌和心肌中实现有效的基因转移。

6、术语“严格”用于指本领域通常理解为严格的条件。杂交的严格性主要由温度、离子強度、以及如甲酰胺等变性剂的浓度決定。用于杂交和洗涤的严格条件的实例是0.015m氯化钠、65℃到68℃下0.0015m柠檬酸钠，或0.015m氯化钠、0.0015m柠檬酸钠和42℃下50％甲酰胺。参见sambrook等人《分子克隆：实验室手册(molecular cloning:a laboratory manual)》，第2版，冷泉港实验室，(纽约冷泉港，1989)。还可以使用更严格的条件(例如更高的温度、更低的离子强度、更高的甲酰胺或其他变性剂)，然而，杂交速率将受到影响。在涉及脱氧寡核苷酸杂交的情况下，另外的示例性严格杂交条件包括在37℃(对于14碱基寡聚物)、48℃(对于17碱基寡聚物)、55℃(对于20碱基寡聚物)和60℃(对于23碱基寡聚物)下在6×ssc 0.05％焦磷酸钠中洗涤。

7、为了减少非特异性和/或背景杂交，可以在杂交和洗涤缓冲液中包含其他试剂。例子是0.1％牛血清白蛋白、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％焦磷酸钠、0.1％十二烷基硫酸钠、nadodso4、(sds)、ficoll、denhardt溶液、超声处理鲑鱼精子dna(或其他非互补dna)和葡聚糖硫酸盐，尽管也可以使用其他合适的试剂。可以改变这些添加剂的浓度和类型，而基本上不影响杂交条件的严格性。杂交实验通常在ph 6.8-7.4下进行，然而，在典型的离子强度条件下，杂交速率几乎与ph无关。参见anderson等人，nucleic acid hybridisation：a practical approach，ch.4，irl press limited(英国牛津)。本领域技术人员可以调节杂交条件以适应这些变量并允许不同序列相关性的dna形成杂交体。

8、术语“肌肉特异性控制元件”是指调节对肌肉组织中表达特异的编码序列的表达的核苷酸序列。这些控制元素包括增强子和启动子。本发明提供了包含肌肉特异性控制元件mckh7启动子、mck启动子和mck增强子的构建体。

9、术语“可操作地连接”是指调节元件核苷酸序列(例如启动子核苷酸序列)的定位，以通过所述调节元件赋予所述核苷酸序列的表达。

10、一方面，本发明提供raav载体，其中肌肉特异性控制元件是人骨骼肌动蛋白基因元件、心肌肌动蛋白基因元件、肌细胞特异性增强子结合因子(mef)、肌肉肌酸激酶(mck)、截短的mck(tmck)、肌球蛋白重链(mhc)、杂合α-肌球蛋白重链增强子/mck增强子启动子(mhck7)、c5-12、鼠肌酸激酶增强子元件、骨骼快肌纤维肌钙蛋白c基因元件、慢肌纤维心脏肌钙蛋白c基因元件、慢肌纤维肌钙蛋白i基因元件、缺氧诱导核因子、类固醇诱导元件或糖皮质激素反应元件(gre)。

11、例如，肌肉特异性控制元件是mhck7启动子核苷酸序列seq id no：2或肌肉特异性控制元件是mck核苷酸序列seq id no：4。另外，在本发明的任何raav载体中，肌肉特异性控制元件核苷酸序列，例如mhck7或mck核苷酸序列，与编码微肌营养不良蛋白的核苷酸序列可操作地连接。例如，mhck7启动子核苷酸序列(seq id no：2)与人微肌营养不良蛋白编码序列(seq id no：1)可操作地连接，如图1或图10中提供的构建体(seq id no：

12、3)中所示。在另一个实例中，mck启动子(seq id no：4)与人微肌营养不良蛋白编码序列(seq id no：1)可操作地连接，如图7或图11中提供的构建体(seq id no：5)中所示。另一方面，本发明提供了raav载体，其包含seq id no：1和seq id no：2的核苷酸序列。本发明还提供了包含seq id no：1和seq id no：4的核苷酸序列的raav载体。

13、在另一方面，本发明提供了raav载体，其包含seq id no：3或seq id no：5的核苷酸序列。例如，raavrh74.mhck7.微肌营养不良蛋白载体包含seq id no：3的核苷酸序列并显示在图10中。该raav载体包含mhck7启动子、嵌合内含子序列、人微肌营养不良蛋白基因的编码序列、polya、氨苄青霉素抗性和具有pbr322起点或复制的pgex质粒骨架。

14、本发明提供了重组aav载体，其包含seq id no：1的人微肌营养不良蛋白核苷酸序列和seq id no：3的mhck7启动子核苷酸序列。该raav载体是aav血清型aavrh.74。

15、本发明还提供了重组aav载体，其包含seq id no：3的paav.mhck7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列。该raav载体是aav血清型aavrh.74。

16、本发明的raav载体可以是任何aav血清型，例如血清型aavrh.74、aav1、aav2、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12或aav13。

17、本发明还提供了包含任何本发明的raav载体的药物组合物(或有时在本文中简称为“组合物”)。

18、在另一个实施方案中，本发明提供产生raav载体颗粒的方法，包括培养已用本发明的任何raav载体转染的细胞，并从转染细胞的上清液中回收raav颗粒。本发明还提供了包含本发明的任何重组aav载体的病毒颗粒。

19、本发明提供治疗肌营养不良症的方法，包括给予治疗有效量的任何表达人微肌营养不良蛋白的本发明重组aav载体。

20、本发明提供治疗肌营养不良症的方法，包括给予治疗有效量的重组aav载体，该载体包含seq id no：1的人微肌营养不良蛋白核苷酸序列和seq id no：2的mhck7启动子核苷酸序列。

21、本发明还提供治疗肌营养不良症的方法，包括给予治疗有效量的重组aav载体，其包含seq id no：3的paav.mhck7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列。

22、“纤维化”是指细胞外基质(ecm)组分的过度的或未调节的沉积以及在损伤后组织中的异常修复过程，所述组织包括骨骼肌、心肌、肝脏、肺、肾和胰腺。被沉积的ecm组分包括纤连蛋白和胶原蛋白，例如胶原蛋白1、胶原蛋白2或胶原蛋白3。

23、本发明还提供减少或预防患有肌营养不良症的受试者的纤维化的方法，包括给予治疗有效量的本发明的任何重组aav载体。

24、在另一个实施方案中，本发明提供了预防有此需要的受试者的纤维化的方法，包括给予治疗有效量的本发明的重组aav载体。例如，可以将本发明的任何raav施用于患有肌营养不良的受试者以预防纤维化，例如在受试者中观察到纤维化之前施用的表达人微肌营养蛋白的本发明的raav。此外，表达人微肌营养不良蛋白基因的本发明的raav可被施用于有发展纤维化风险的受试者，例如患有或诊断患有肌营养不良症例如dmd的那些。本发明的raav可以施用于患有肌营养不良症的受试者，以防止这些受试者中的新纤维化。

25、本发明考虑在受试者中观察到纤维化之前给予本发明的任何aav载体。此外，本发明的raav可以施用于有发展纤维化风险的受试者，例如患有或诊断患有肌营养不良症例如dmd的那些。本发明的raav可以施用于已经患有纤维化的患有肌营养不良症的受试者，以便在这些受试者中预防新的纤维化。

26、本发明还提供增加患有肌营养不良症的受试者的肌肉力量和/或肌肉量的方法，包括给予治疗有效量的表达人微肌营养不良蛋白基因的本发明的raav载体。这些方法可以进一步包括施用表达微肌营养不良蛋白的raav的步骤。

27、本发明考虑将本发明的任何aav载体在受试者中观察到纤维化之前或在肌肉力量减少之前或肌肉量减少之前给予被诊断患有dmd的患者。

28、本发明还考虑将本发明的aav给予已经患有纤维化的患有肌营养不良的受试者，以便预防这些受试者中的新纤维化或减少这些患者的纤维化。本发明还提供给患有肌肉营养不良的患者施用本发明的任何raav，所述患者已经具有减小的肌肉力量或具有减少的肌肉量，以保护肌肉免受进一步的损伤。

29、在本发明的任何方法中，受试者可能患有肌营养不良症例如dmd或任何其他肌营养不良蛋白相关的肌营养不良症。

30、另一方面，表达微肌营养不良蛋白的raav载体包含微肌营养不良蛋白基因的编码序列，其可操作地连接于除mhck7或mck之外的肌肉特异性控制元件。例如，其中肌肉特异性控制元素是人骨骼肌动蛋白基因元件、心肌肌动蛋白基因元件、肌细胞特异性增强子结合因子mef、tmck(截短的mck)、肌球蛋白重链(mhc)、c5-12、鼠肌酸激酶增强子元件、骨骼快肌纤维肌钙蛋白c基因元件、慢肌纤维心脏肌钙蛋白c基因元件、慢肌纤维肌钙蛋白i基因元件、缺氧诱导核因子、类固醇诱导元件或糖皮质激素反应元件(gre)。

31、在本发明的任何方法中，raav载体或组合物可以通过肌内注射或静脉内注射给药。

32、此外，在本发明的任何方法中，raav载体或组合物可以全身给药。例如，raav载体或组合物可以通过注射、输注或植入进行肠胃外给药。

33、在另一个实施方案中，本发明提供了包含本发明的任何raav载体的组合物，用于减少有此需要的受试者的纤维化。

34、此外，本发明提供了一种组合物，其包含本发明的任何重组aav载体，用于预防患有肌营养不良症的患者的纤维化。

35、本发明提供了包含本发明的任何重组aav载体的组合物，用于治疗肌营养不良症。

36、本发明提供了包含重组aav载体的组合物，所述重组aav载体包含seq id no：1的人微肌营养不良蛋白核苷酸序列和seq id no：2的mhck7启动子序列，用于治疗肌营养不良症。

37、本发明提供了包含重组aav载体的组合物，所述重组aav载体包含paav.mhck7.微肌营养不良蛋白构建体，其包含seq id no：3的核苷酸序列，用于治疗肌营养不良症。

38、本发明还提供了包含本发明的任何raav载体的组合物，用于增加患有肌营养不良的受试者的肌肉力量和/或肌肉量。在另一个实施方案中，本发明提供了包含本发明的任何raav载体的组合物，用于治疗肌营养不良症。

39、本发明的组合物可以配制用于肌内注射或静脉内注射。本发明的组合物还配制用于全身给药，例如通过注射、输注或植入进行肠胃外给药。

40、此外，可以配制任何组合物用于给予患有肌营养不良症例如dmd或任何其他肌营养不良蛋白相关的肌营养不良症的受试者。

41、在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的任何raav载体在制备用于减少有此需要的受试者的纤维化的药物中的用途。例如，有需要的受试者可能患有肌营养不良症，例如dmd或任何其他肌营养不良蛋白相关的肌营养不良症。

42、在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的raav载体在制备药物中的用途，所述药物用于预防患有肌营养不良的受试者的纤维化。

43、此外，本发明提供了本发明的重组aav载体在制备药物中的用途，所述药物用于增加患有肌营养不良的受试者的肌肉力量和/或肌肉量。

44、本发明还提供了本发明的raav载体在制备用于治疗肌营养不良症的药物中的用途。

45、本发明提供了包含seq id no：1的人微肌营养不良蛋白核苷酸序列和seq id no：2的mhck7启动子核苷酸序列的重组aav载体在制备用于治疗肌营养不良症的药物中的用途。

46、本发明提供了包含seq id no：3的paav.mhck7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列的重组aav载体用于治疗肌营养不良的用途。

47、在本发明的任何用途中，药物可以配制成用于肌内注射或静脉内注射。此外，在本发明的任何用途中，药物可以配制用于全身给药，例如通过注射、输注或植入进行肠胃外给药。

48、可以制备任何药物用于给予患有肌营养不良症例如dmd或任何其他肌营养不良蛋白相关的肌营养不良症的受试者。