识别KRASG12D7-16短肽的T细胞受体

本发明涉及识别kras g12d7-16短肽的t细胞受体，本发明还涉及能够识别源自人kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(kras)g12d突变抗原的t细胞受体(tcr)，本发明还涉及转导上述tcr来获得的kras g12d特异性的t细胞，及他们在预防和治疗含kras g12d突变的相关疾病中的用途。

背景技术：

1、体细胞突变的积累促进肿瘤发生。人kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(kras)为致癌驱动基因，编码kras蛋白，调控细胞的增殖。突变的kras蛋白处于组成型活化状态，导致不受控制的细胞增殖(awad,m.m.,et al.n engl j med,2021)。超过80％的胰腺癌、30-50％的结直肠癌、35％的肺癌、21-33％的多发性骨髓瘤、7-18％的宫颈腺癌、17.4％的甲状腺癌、8-13％的乳腺癌、3-13％的胃癌、9.1％的前列腺癌、7％的肝癌、4％的膀胱癌和1.6％的食管癌等常见或高死亡率肿瘤病例均发生kras突变。在kras基因中，最常见的突变造成第12、13和61位氨基酸改变。在胰腺癌患者中，99％的kras突变发生在12位的甘氨酸(g)，g突变为天冬氨酸(d)的比例为49％；在肺癌患者中，92％的kras突变发生在12位的g，g突变为d的比例为17％；在结直肠癌患者中，80％的kras突变发生在12位的g，g突变为d的比例为35％。突变的kras能被主要组织相容性复合物(mhc，人源的mhc称为hla)呈递于细胞表面，成为新抗原，能被免疫细胞识别。手术、化疗、放疗和小分子药物等依然是癌症常规一线治疗手段，但肿瘤常复发和频繁耐药。这些治疗策略导致恶性肿瘤患者的5年存活率很低，特别是胰腺癌。

2、基于t细胞是抗肿瘤免疫的关键参与者，目前，癌症免疫疗法的核心研究方向是诱导t细胞的抗肿瘤反应。t细胞过继免疫治疗是将对靶抗原具有特异反应的t细胞回输至患者体内，使其对含有靶抗原的目标细胞特异性地发挥作用。tcr是t细胞表面的膜蛋白，其与cd3形成复合体，能够识别靶细胞由hla呈递于细胞表面的抗原，即hla-短肽复合物(phla)，引发t细胞的信号激活和传递，导致t细胞对靶细胞的裂解，从而发挥抗肿瘤等免疫效应。

3、因此，本领域技术人员致力于分离出对kras g12d突变抗原具有特异性识别的tcr，将该tcr转导t细胞，获得对kras g12d突变抗原具有特异性识别的t细胞，使他们在免疫细胞治疗中发挥作用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供对kras g12d突变抗原具有特异性识别的tcr。

2、本发明的另一目的是提供一种能够结合hla-a*11:01呈递的vvvgadgvgk短肽(kras g12d7-16)的tcr，以及编码所述tcr的核酸分子和包含所述核酸分子的载体。另外，本发明还提供了转导本发明tcr的细胞。

3、本发明第一方面提供了一种t细胞受体(tcr)，所述tcr能够与vvvgadgvgk-hla-a*11:01复合物结合。

4、在另一优选例中，所述tcr包含tcrα链可变域和tcrβ链可变域，所述tcrα链可变域的cdr3的氨基酸序列为avrdsegystltf(seq id no:19)；和/或所述tcrβ链可变域的cdr3的氨基酸序列为asspgglayneqff(seq id no:22)。

5、在另一优选例中，所述tcrα链可变域的3个互补决定区(cdr)为：

6、αcdr1:tsgfng(seq id no:17)

7、αcdr2:nvldgl(seq id no:18)和

8、αcdr3:avrdsegystltf(seq id no:19)；和/或

9、所述tcrβ链可变域的3个互补决定区为：

10、βcdr1:lnhda(seq id no:20)

11、βcdr2:sqivnd(seq id no:21)和

12、βcdr3:asspgglayneqff(seq id no:22)。

13、在另一优选例中，所述tcr包含tcrα链可变域和tcrβ链可变域，所述tcrα链可变域为与seq id no：2具有至少90％序列相同性的氨基酸序列；和/或所述tcrβ链可变域为与seq id no:10具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。

14、在另一优选例中，所述tcr包含α链可变域氨基酸序列seq id no:2。

15、在另一优选例中，所述tcr包含β链可变域氨基酸序列seq id no:10。

16、在另一优选例中，所述tcr为αβ异质二聚体，其包含tcrα链恒定区trac*01和tcrβ链恒定区trbc1*01或trbc2*01。

17、在另一优选例中，所述tcr的α链氨基酸序列为seq id no：4、6、8和/或所述tcr的β链氨基酸序列为seq id no:12、14、16。

18、在另一优选例中，所述tcr是可溶的。

19、在另一优选例中，所述tcr包括(a)除跨膜结构域以外的全部或部分tcrα链；以及(b)除跨膜结构域以外的全部或部分tcrβ链；

20、并且(a)和(b)各自包含功能性可变结构域,或包含功能性可变结构域和所述tcr链恒定结构域的至少一部分。

21、在另一优选例中，所述tcr能够特异性结合kras突变短肽。

22、在另一优选例中，所述短肽含第12位甘氨酸(g)的突变。

23、在另一优选例中，所述短肽的第12位g突变为天冬氨酸(d)。

24、在另一优选例中，所述短肽为：vvvgadgvgk。

25、在另一优选例中，所述tcr为单链。

26、在另一优选例中，tcr是由α链可变域与β链可变域通过连接肽序列连接而成。

27、在另一优选例中，半胱氨酸残基在所述tcr的α和β链恒定域之间形成人工二硫键。

28、在另一优选例中，在所述tcr中形成人工二硫键的半胱氨酸残基取代了选自下列的一组或多组位点：

29、trac01外显子1的thr48和trbc1*01或trbc2*01外显子1的ser57；

30、trac01外显子1的thr45和trbc1*01或trbc2*01外显子1的ser77；

31、trac01外显子1的tyr10和trbc1*01或trbc2*01外显子1的ser17；

32、trac01外显子1的thr45和trbc1*01或trbc2*01外显子1的asp59；

33、trac01外显子1的ser15和trbc1*01或trbc2*01外显子1的glul5；

34、trac01外显子1的arg53和trbc1*01或trbc2*01外显子1的ser54；

35、trac01外显子1的pro89和trbc1*01或trbc2*01外显子1的alal9；和

36、trac01外显子1的tyr10和trbc1*01或trbc2*01外显子1的glu20。

37、在另一优选例中，所述tcr的α链可变区与β链恒定区之间含有人工链间二硫键。

38、在另一优选例中，所述tcr在α链可变区氨基酸第11、13、19、21、53、76、89、91或94位，和/或α链j基因短肽氨基酸倒数第3位、倒数第5位或倒数第7位中具有一个或多个突变；和/或所述tcr在β链可变区氨基酸第11、13、19、21、53、76、89、91或94位，和/或β链j基因短肽氨基酸倒数第2位、倒数第4位或倒数第6位中具有一个或多个突变，其中氨基酸位置编号按imgt(国际免疫遗传学信息系统)中列出的位置编号。

39、在另一优选例中，所述tcr包含α链可变域和β链可变域以及除跨膜结构域以外的全部或部分β链恒定域，但其不包含α链恒定域，所述tcr的α链可变域与β链形成异质二聚体。

40、在另一优选例中，所述tcr的α链和/或β链的c-或n-末端结合有偶联物。

41、在另一优选例中，与所述t细胞受体结合的偶联物为可检测标记物、治疗剂、pk修饰部分或任何这些物质的组合。

42、在另一优选例中，所述可检测标记物包括：荧光或发光标记物、放射性标记物、mri(磁共振成像)或ct(电子计算机x射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。

43、在另一优选例中，所述治疗剂包括：放射性核素、生物毒素、细胞因子(如il-2等)、抗体、抗体fc片段、抗体scfv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如dt-心肌黄酶(dtd)或联苯基水解酶-样蛋白质(bi3/4l))、化疗剂(如顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

44、在另一优选例中，与所述t细胞受体结合的治疗剂为连接于所述tcr的α或β链的c或ν末端的抗-cd3抗体、抗-cd3抗体的重链可变区(vh)或轻链可变区(vl)、或任何与cd3特异性结合的蛋白质、小分子化合物或有机大分子化合物。

45、在另一优选例中，所述治疗剂为抗-cd3抗体。

46、本发明第二方面提供了一种多价tcr复合物，其包含至少两个tcr分子，并且其中的至少一个tcr分子为本发明第一方面所述的tcr。

47、本发明第三方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码本发明第一方面所述的tcr分子的核酸序列或其互补序列。

48、在另一优选例中，所述核酸分子包含编码tcrα链可变域的核苷酸序列seq id no：1。

49、在另一优选例中，所述的核酸分子包含编码tcrβ链可变域的核苷酸序列seq idno：9。

50、在另一优选例中，所述核酸分子包含编码tcrα链的核苷酸序列seq idno:3、seqid no:5和seq id no:7。

51、在另一优选例中，所述核酸分子包含编码tcrβ链的核苷酸序列seq idno:11、seqid no:13和seq id no:15。

52、本发明第四方面提供了一种载体，所述的载体含有本发明第三方面所述的核酸分子；优选地，所述的载体为病毒载体；更优选地，所述的载体为慢病毒载体。

53、本发明第五方面提供了一种分离的宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本发明第四方面所述的载体或基因组中整合有外源的本发明第三方面所述的核酸分子。

54、本发明第六方面提供了一种细胞，所述细胞转导本发明第三方面所述的核酸分子或本发明第四方面所述的载体；优选地，所述细胞为t细胞或干细胞。

55、本发明第七方面提供了一种药物组合物，所述组合物含有药学上可接受的载体以及本发明第一方面所述的tcr、本发明第二方面所述的tcr复合物、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的载体、或本发明第六方面所述的细胞。

56、本发明第八方面提供了本发明第一方面所述的t细胞受体、或本发明第二方面所述的tcr复合物、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的载体、或本发明第六方面所述的细胞的用途，用于制备治疗肿瘤的药物。

57、本发明第九方面提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明第一方面所述的t细胞受体、或本发明第二方面所述的tcr复合物、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的载体、或本发明第六方面所述的细胞、或本发明第七方面所述的药物组合物。

58、在另一优选例中，所述的疾病为肿瘤。

59、在另一优选例中，所述的疾病为含kras g12d突变的肿瘤。

60、在另一优选例中，所述肿瘤包括胰腺癌、结直肠癌、肺癌、多发性骨髓瘤、宫颈腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌和食管癌等。

61、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。