一种shRNA腺相关病毒载体及其构建方法和应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种shrna腺相关病毒载体及其构建方法和应用。

背景技术：

1、心血管疾病是2型糖尿病(type 2diabetes，t2d)患者发病和死亡的主要原因。据估计，与非糖尿病患者相比，2型糖尿病患者的心血管疾病发病率至少高出2至4倍。2型糖尿病导致代谢异常，包括慢性高血糖、血脂异常、胰岛素抵抗和炎症。这些过程最终会导致血管内皮损伤，破坏血管稳态和通透性的维持，从而促进心血管疾病的发展。血管内皮功能障碍被认为是2型糖尿病各阶段血管并发症的根本原因。然而，目前对于防控2型糖尿病血管内皮功能障碍发生的诊断手段非常匮乏，尚无公认有效的2型糖尿病血管内皮功能障碍治疗手段。因此，寻找有效的2型糖尿病血管内皮功能分子靶点十分迫切。

2、精氨酸酶(arg)是一种双核锰金属酶，可催化l-精氨酸水解，主要产生l-鸟氨酸和尿素。精氨酸酶有两种异构体，即arg1和arg2，存在于脊椎动物(包括哺乳动物)中。尽管arg1和arg2具有相同的催化反应，但它们由不同的基因编码，并表现出不同的免疫学特征。内皮细胞中arg1活性升高已被确定为2型糖尿病患者血管内皮功能障碍的重要促成因素。这种功能障碍归因于arg1和enos之间对l-精氨酸的竞争导致ros的过度形成。因此，氧化酶或线粒体复合物过度激活，导致no水平降低，进而导致内皮功能障碍。相反，抑制arg1的表达已被证明可显着增强2型糖尿病患者的内皮功能。鉴于目前2型糖尿病诱导血管内皮功能障碍的调控机制仍不清楚，临床上尚缺乏针对2型糖尿病血管内皮功能障碍的有效防治药物。

3、近年来，腺相关病毒(aav)属于微小病毒科依赖病毒属，是目前发现的一类结构最简单的单链dna缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒或者疱疹病毒)参与复制，野生型的腺相关病毒由两个末端的反向重复(itr)和一个cap和rep基因组成，病毒基因组长约有4.7kb，目前未发现aav与任何疾病相关。重组腺相关病毒载体(raav)源于非致病的野生型腺相关病毒，它剔除了aav基因组全部编码蛋白rep或cap基因序列，只在两端保留作为包装信号的反式dna序列(即itr)。由于其安全性高、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，组织特异性亲和能力强以及在体内持续稳定表达等特性，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种shrna腺相关病毒载体及其构建方法和应用，解决2型糖尿病体内arg1异常表达增加的问题。

2、本发明提供了一种靶向抑制arg1表达的shrna，所述shrna的干扰靶点包括arg1-shrna1或arg1-shrna2；

3、其中，所述arg1-shrna1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述arg1-shrna2的核苷酸序列如seq id no.2所示。

4、优选的，其中所述arg1-shrna1的干扰序列包括seq id no.10所示的正义链和seqid no.11所示的反义链；

5、所述arg1-shrna2的干扰序列包括seq id no.4所示的正义链和seq idno.5所示的反义链。

6、本发明还提供了一种包含上述shrna2的穿梭质粒。

7、本发明还提供了一种携带上述shrna2的重组腺相关病毒载体，包括上述穿梭质粒、paav-mcs质粒和phelper质粒。

8、优选的，所述重组腺相关病毒载体为aav9血清型。

9、本发明还提供了一种将上述重组腺相关病毒载体侵染真核细胞后获得的重组腺相关病毒。

10、优选的，所述真核细胞包括人胚肾细胞。

11、本发明还提供了上述shrna2、上述穿梭质粒、上述重组腺相关病毒载体或上述重组腺相关病毒在制备治疗血管内皮功能障碍的药剂中的应用。

12、优选的，所述血管内皮功能障碍为2型糖尿病诱导的血管内皮功能障碍。

13、本发明还提供了一种治疗血管内皮功能障碍的药物，活性成分包括上述shrna、上述穿梭质粒、上述重组腺相关病毒载体或上述重组腺相关病毒。

14、有益效果：本发明提供了一种靶向抑制arg1表达的shrna，并基于所述shrna构建了穿梭质粒、重组腺相关病毒载体和重组腺相关病毒，利用重组腺相关病毒(aav)作为载体，携带arg1-shrna序列，所述arg1-shrna干扰质粒能显著特异性抑制arg1的表达；在进行重组腺相关病毒的包装，只对shrna2进行了包装，arg1-shrna重组腺相关病毒能够改善小鼠血管内皮舒张功能，恢复no含量和enos活性，抑制ros和黏附因子的表达，从而起到抵抗2型糖尿病诱导的血管内皮功能障碍的作用，在治疗2型糖尿病血管功能方面具有潜在应用价值。

15、本发明通过实验证明了利用腺相关病毒作为载体携带arg1-shrna序列，可以显著减轻2型糖尿病血管内皮功能障碍程度，这为2型糖尿病心血管疾病提供了一种新的靶向arg1的治疗策略，进一步为开发出新型的可有效治疗2型糖尿病血管内皮功能障碍的药物奠定基础。

技术特征：

1.一种靶向抑制arg1表达的shrna，其特征在于，所述shrna的干扰靶点包括arg1-shrna1或arg1-shrna2；

2.根据权利要求1所述shrna，其特征在于，其中所述arg1-shrna1的干扰序列包括seqid no.10所示的正义链和seq id no.11所示的反义链；

3.一种包含权利要求1或2所述shrna的穿梭质粒。

4.一种携带权利要求1所述shrna的重组腺相关病毒载体，其特征在于，包括权利要求3所述穿梭质粒、paav-mcs质粒和phelper质粒。

5.根据权利要求3所述重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述重组腺相关病毒载体为aav9血清型。

6.一种将权利要求4或5所述重组腺相关病毒载体侵染真核细胞后获得的重组腺相关病毒。

7.根据权利要求6所述重组腺相关病毒，其特征在于，所述真核细胞包括人胚肾细胞。

8.权利要求1或2所述shrna、权利要求3所述穿梭质粒、权利要求4或5所述重组腺相关病毒载体或权利要求6或7所述重组腺相关病毒在制备治疗血管内皮功能障碍的药剂中的应用。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述血管内皮功能障碍为2型糖尿病诱导的血管内皮功能障碍。

10.一种治疗血管内皮功能障碍的药物，其特征在于，活性成分包括权利要求1或2所述shrna、权利要求3所述穿梭质粒、权利要求4或5所述重组腺相关病毒载体或权利要求6或7所述重组腺相关病毒。

技术总结本发明提供了一种shRNA腺相关病毒载体及其构建方法和应用，属于生物医药技术领域。本发明提供了一种靶向抑制ARG1表达的shRNA，并基于所述shRNA构建了穿梭质粒、重组腺相关病毒载体和重组腺相关病毒，利用重组腺相关病毒(AAV)作为载体，携带ARG1‑shRNA序列，所述ARG1‑shRNA干扰质粒能显著特异性抑制ARG1的表达，起到抵抗2型糖尿病诱导的血管内皮功能障碍的作用，且安全性高，为2型糖尿病心血管疾病提供了一种新的靶向ARG1的治疗策略。技术研发人员：陈卫,张明,谢亮华,杜廣一受保护的技术使用者：浙江大学技术研发日：技术公布日：2024/8/1