基于靶向胞膜表面受体的稳定高表达人源悬浮细胞系的构建方法与流程

本发明涉及生物，具体涉及基于靶向包膜表面受体的稳定高表达人源悬浮细胞系的构建方法。

背景技术：

1、悬浮细胞是指不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长，这类细胞称为悬浮细胞。常规的基因稳定表达细胞系构建方法有：1、利用脂质体等瞬时转染带抗生素筛选标签(如puromycin)的质粒到细胞中，然后利用抗生素(如puromycin)等进行多代次长时间加压筛选，保留表达抗生素基因的细胞，最终等到稳定表达细胞系；2、利用vsvg包膜蛋白的慢病毒感染细胞，将病毒基因组插入细胞中，然后经过药物或流式筛选得到稳定表达细胞系；3、利用其他基因可插入宿主基因组病毒如逆转录病毒等，以2方法得到稳定表达细胞系。以上三种方法中，最高效、常用的方法为利用vsvg包膜蛋白的慢病毒感染目的细胞的方法。但目前对于多种悬浮细胞系而言，由于其细胞表面的vsvg受体——低密度脂蛋白受体(ldlr)表达水平低，因此vsvg慢病毒感染这些悬浮细胞的效果较差，进而利用vsvg包膜的慢病毒感染构建稳转细胞系的效率较低。

2、增强慢病毒感染能力则可提高稳转悬浮细胞系构建效率。增强慢病毒感染目的细胞能力的方法有：1、利用目的细胞高表达膜蛋白作为另外的受体，包装包膜中含有能够识别该受体的膜蛋白(如表达在细胞膜上的特异性单链抗体scfv)的重靶向慢病毒，重靶向慢病毒利用其包膜中scfv与目的细胞受体的高亲和力相互作用，将病毒与目的细胞拉近，从而促进病毒包膜与细胞质膜的相互融合，增强重靶向慢病毒的感染能力。2、利用其他病毒替换vsvg，更换慢病毒感染模式，使其受体不再是低表达的ldlr，而更换成其他高表达受体。

3、中国专利cn117802158a中公开了一种表达大t抗原的悬浮细胞系的构建方法，通过序列合成、载体构建、质粒转染和细胞株筛选等步骤制得一种表达大t抗原的293悬浮细胞系，而后对构建好的细胞系通过rna提取，反转录而后进行定量pcr检测大t抗原的相对表达量，得到高表达大t抗原的293悬浮细胞系，将包含重组蛋白编码基因的序列构建到常规的真核蛋白表达载体里，进行质粒大抽之后，分别转染293细胞和最终构建好的293-lts细胞，然后进行基因表达水平的检测，最终构建好的高表达大t抗原的293悬浮细胞系可以用于重组蛋白及重组抗体表达的宿主细胞，有助于提高转染效率和目标蛋白的表达量。

4、但现有技术中未检索到靶向包膜表面受体cd19构建稳定高表达人源悬浮细胞系(cd19阳性悬浮细胞系)的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种基于靶向包膜表面受体的稳定高表达人源悬浮细胞系的构建方法。

2、为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

3、一方面，本发明提供了一种基于靶向包膜表面受体的稳定高表达人源悬浮细胞系的构建方法，包括以下步骤：

4、(1)构建重靶向cd19慢病毒表达载体plq153或plq154；

5、plq153的序列如seq id no.10所示，plq154的序列如seq id no.12所示；

6、(2)利用四质粒系统，重靶向包膜表达载体plq153或plq154、包装质粒1、包装质粒2和包膜质粒进行重靶向cd19慢病毒包装；

7、(3)加入对应moi的慢病毒感染目的细胞，并加入促感染试剂。

8、优选地，步骤(1)中重靶向cd19的慢病毒表达载体为plq154。

9、具体地，步骤(1)中所述的重靶向cd19慢病毒表达载体plq153的构建方法为：合成fmc63(seq id no.5)、cd28a hinge(seq id no.6)、cd28a tm(seq id no.7)、p2a(seq idno.8)串连序列(seq id no.9)，将串联序列构建进载体中，得到plq153(seq id no.10)重靶向cd19慢病毒表达载体。

10、具体地，步骤(1)中所述的重靶向cd19慢病毒表达载体plq154的构建方法为：将icam1 tm(seq id no.11)替换cd28a tm，得到plq154(seq id no.12)重靶向cd19慢病毒载体。

11、具体地，所述的将串联序列构建进表达载体中的方法为通过限制性酶切位点ecori/bamhi。

12、具体地，步骤(1)中所述的载体为pcdh-gfp。

13、具体地，步骤(2)中所述的包装质粒1为plp1，序列如seq id no.2所示；所述的包装质粒2为plp2，序列如seq id no.3所示；所述的包膜质粒为pvsvg，序列如seq id no.4所示。

14、具体地，步骤(2)中所述的重靶向cd19慢病毒包装包括以下步骤：

15、①接种hek293t细胞至培养皿中培养；

16、②进行质粒转染：质粒plq153或plq154、plp1、plp2、pvsvg的比例为(8-12)：(3-6)：(3-6)：(3-6)，使用转染试剂进行转染；

17、③离心，过滤，收集上清，浓缩病毒。

18、具体地，步骤①中每皿的细胞数为4×106。

19、具体地，步骤②中质粒plq153或plq154、plp1、plp2、pvsvg的比例为10：5：5：5。

20、进一步地，步骤②中质粒plq153或plq154、plp1、plp2、pvsvg的比例为10ug：5ug：5ug：5ug。

21、具体地，步骤②中所述的转染试剂选自pei、lipofectamine3000、peipro中的一种或多种。

22、进一步地，步骤②中所述的转染试剂为pei。

23、进一步地，所述的pei与总dna的比例为(1-5)：1；再进一步地，所述的pei与总dna的比例为2.5：1。

24、具体地，步骤②中所述的转染的时间为6-8h。

25、进一步地，转染6-8h后换液为含5％ fbs的新鲜dmem培养基。

26、具体地，步骤③中离心的转速为1000-3000g，离心的时间为5-20min；

27、进一步地，步骤③中离心的转速为2000g，离心的时间为10min。

28、具体地，步骤③中浓缩的方法为在4℃条件下，15000-25000g离心1-3h。

29、进一步地，步骤③中浓缩的方法为在4℃条件下，20000g离心2h。

30、进一步地，步骤(3)中所述的促感染试剂为polybrene。

31、进一步地，所述的促感染试剂的浓度为6-10ug/ml；

32、再进一步地，所述的促感染试剂的浓度为8ug/ml。

33、具体地，步骤(3)中所述的目的细胞为悬浮细胞。

34、进一步地，所述的悬浮细胞包括asct1或asct2高表达细胞系。

35、再进一步地，所述的悬浮细胞包括raji细胞、ramos细胞、k562细胞、rmpi8226细胞。

36、更进一步地，所述的悬浮细胞包括raji细胞和ramos细胞。

37、具体地，步骤(3)中加入促感染试剂，48hpt(hour post transfection)流式检测gfp细胞阳性率及平均荧光强度。

38、具体地，步骤(3)中moi可选自1、2.5、5、10。

39、又一方面，本发明提供了上述的构建方法构建得到的细胞系。

40、具体地，所述的细胞系为悬浮细胞系。

41、进一步地，所述的悬浮细胞系为asct1或asct2高表达细胞系。

42、再进一步地，所述的悬浮细胞系包括raji细胞系、ramos细胞系、k562细胞系、rmpi8226细胞系。

43、更进一步地，所述的悬浮细胞包括raji细胞和ramos细胞。

44、本发明的有益效果为：

45、本发明提供了一种基于增加受体的稳定高表达人源悬浮细胞系的构建方法，利用悬浮细胞表面高表达蛋白cd19作为重靶向受体，重靶向cd19慢病毒感染悬浮细胞的感染强度和感染水平有显著提升，对于构建高表达人源悬浮细胞系的构建具有非常好的效果。