用于检测五指山猪背最长肌基因的特异性SVs与SNPs分子标记组合及筛选方法和应用

本发明属于分子生物学领域，具体涉及用于检测五指山猪背最长肌基因的特异性svs及其区域内snps分子标记组合、筛选方法和应用。

背景技术：

1、五指山猪是一种海南省本地的小型猪，具有耐粗饲、瘦肉率高、肉质鲜嫩等特征[1]。此外，由于五指山猪和人类在解剖学、生理结构、遗传学等方面相似度较高，是一种理想的人类疾病转化医学研究动物模型[2-3]。然而，由于五指山猪生长速度缓慢，料肉比率低，直接影响了其市场规模和经济效益。养殖场通常采用引进国外培育的具有优良性能的猪品种，包括大白猪、长白猪、杜洛克猪等，通过杂交育种的方式获得杂种优势，提高五指山猪生长速度。然而，杂种优势不能稳定遗传，生产性能可能出现较大水平差异。因此，需要从基因组层面，比较五指山猪和其它猪品种的遗传和变异差异，筛选出五指山猪背最长肌基因特异性结构突变及其它变异特征，进一步分析突变对肌肉生长的影响和功能，为基因结构的定向选育提供理论支持。

2、基因组结构变异(structure variantions，简称svs)，通常指基因组长度较长的序列变化和位置关系变化。包括长度在50bp以上的长片段序列插入或者删除(big indel)、串联重复(tandem repeate)、染色体倒位(inversion)、染色体内部或染色体之间的序列易位(translocation)、拷贝数变异(cnv)以及形式更为复杂的嵌合性变异。svs大部分位于基因上下游区域或内含子区域，主要具有调控作用，基因编码区svs极少。宁乡猪和杜洛克猪对比分析发现，宁乡猪的一些svs与脂肪代谢、免疫反应和神经系统功能相关[4]。通过检测国内品种猪群体，发现一些基因(fibronectin type iii and spry domain containing2，(fsd2)；wasp like actin nucleation promoting factor，(wasl))svs与肉质、肌纤维体积有关联[5]。这些结果反映了中国不同地域不同猪品种的生长状态差异。

3、二代测序变异检测的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snps)，数量较多，是最丰富的变异种类。虽然大部分snps位于基因上下游区域、5’utr、3’utr区域或内含子区域，检测到的编码序列snps仍然是数量最多的变异种类。基因结构非常复杂，外显子可能与5’utr重合，或者选择性剪接产生不同的转录本，然而，编码序列始终位于5’utr和3’utr区域之间，经过转录和翻译等过程行使基因的功能。而且大部分位于编码序列的snps只导致编码氨基酸的密码子改变，不会引起氨基酸变化，即同义密码子。全基因组重测序分析发现五指山猪一些基因与免疫反应和肉质有关[6]；野猪和驯养猪拷贝数变异和肉质、生长发育和免疫反应有关[7]。这些研究结果表明snps等短序列突变可能与肌肉生长有关。

4、从进化角度来说，一般情况下，变异对稳定的物种群体弊大于利。除了少数情况下，地球发生剧烈的地质变化或环境气候发生巨大动荡，原来的栖息地不适合物种生存，只有新的变异衍化出的性状能够帮助物种生存，大部分变异是有害的。这个观点符合不同类型的变异都是多数位于调控区域且同义突变占绝大比例的现象。svs虽然数量较少，但是属于大片段变异，对基因功能影响较大，通常位于基因上下游区域、启动子区域、内含子等调控区域，编码区域svs较少；相对来说，snps数量众多，分布广泛，几乎所有基因结构都存在snps，但是缺乏特异性，目前已知的研究结果，除了氟烷基因作为主效基因导致猪应激综合征，其它大部分情况都存在多基因多位点效应，难以准确定位发挥作用的snps位点。因此，svs和snps等不同类型变异对基因功能的影响不同，都有各自的优势和局限性。鉴于以上问题，本发明结合svs与snps不同变异类型特征，分析五指山猪和大白猪肌肉生长发育基因差异突变序列，筛选五指山猪背最长肌基因特异性svs与snps组合，为遗传育种的基因定向选育方向提供借鉴。

技术实现思路

1、针对上述问题中存在的不足之处，本发明提供一种用于检测五指山猪背最长肌基因的特异性svs分子标记组合，所述svs标记的序列信息如表格1中编号1至编号78所示。

2、本发明还提供一种用于检测五指山猪背最长肌基因的特异性snps分子标记组合，所述snps分子标记位于上述svs区域范围内，所述snps标记的位点信息如表格2中编号1至编号104所示。

3、本发明还提供一种用于检测五指山猪背最长肌基因的特异性svs及其区域范围内snps分子标记组合，包括五指山猪背最长肌基因特异性svs及其区域内snps分子标记，所述五指山猪背最长肌基因特异性svs及其区域内snps序列信息如表格3中编号1至编号39所示。

4、本发明还提供一种检测物质，所述检测物质包括具有下列功能的探针，

5、所述能够检测上述svs分子标记组合，所述svs探针序列信息如表格4中编号1至编号78所示；

6、表4用于检测五指山猪背最长肌基因的特异性svs标记的探针序列

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19、和/或,(2)所述探针能够检测根据上述snps分子标记组合，所述snps探针序列信息如表格5中编号1至编号104所示。

20、表5用于检测五指山猪背最长肌基因特异性snps标记的探针序列

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26、本发明还提供一种包含上述检测物质的检测产品，所述检测产品可为试剂盒和/或芯片。

27、本发明还提供一种用于检测五指山猪背最长肌基因特异性svs及其区域内snps标记组合的筛选方法，包括如下步骤：

28、步骤一、分析五指山猪和大白猪基因组三代变异测序数据，提取svs；过滤条件：50bp≤svs≤1mb，score≥10；

29、步骤二、筛选五指山猪背最长肌基因特异性svs，设计合成svs探针；

30、步骤三、分析五指山猪全基因组二代测序数据，提取snps；

31、步骤四、根据步骤二和步骤三筛选五指山猪背最长肌基因特异性svs区域范围内snps；

32、步骤五、统计步骤四svs的基因位置和结构变异种类；

33、步骤六、保留步骤四中基因5’utr至3’utr区域svs和snps，合并五指山猪背最长肌基因特异性svs及svs区域范围内snps，即为五指山猪背最长肌基因的特异性svs和snps标记组合；设计合成svs和snps探针；

34、作为本发明进一步的改进，所述步骤二中背最长肌基因特异性svs信息如说明书表1中编号1至编号78所示。

35、作为本发明进一步的改进，所述步骤二中设计svs探针的方法分为三种：在svs交界点两边外侧附近(不包含svs)分别设计一个探针(共2个探针)；svs交界点两边内测附近(svs区域)分别设计一个探针(共2个探针)；svs长度小于120bp则在svs交界点两边外侧(不包含svs)选取一端设计1个探针，并在svs区域内部设计1个探针(共2个探针)。所述svs探针是长度为120bp的单链dna，设计2个探针同时捕获svs交界点附近的目标序列，检测svs序列。

36、作为本发明进一步的改进，所述步骤四中背最长肌基因特异性svs区域内snps标记的序列信息如说明书表2中编号1至编号104所示；设计的snps探针是长度为120bp的单链dna，并且，五指山猪背最长肌特异性svs区域的snps标记放置在探针序列的中间位置，snps探针通过捕获snps附近目标序列，检测snps。检测方法与探针检测svs序列类似。

37、作为本发明进一步的改进，所述步骤六中筛选svs和snps的范围是基因5’utr至3’utr区域内。

38、作为本发明进一步的改进，所述步骤一中具体步骤是：采集3头五指山猪和3头大白猪背最长肌组织，用干冰寄送至北京诺禾致源科技股份有限公司，pacbio三代测序平台建库测序，测序大约15×。原始数据与参考基因组(sscrofa 11.1)比对。使用sniffles和pbsv软件的默认参数检测sv，包括缺失(deletions，dels)、插入(insertions，inss)、重复(duplication,dup)、倒位(inversions,invs)和易位(translocations，tras)。分别将两个品种的3个重复样本svs合并，获得五指山猪和大白猪两个品种svs。

39、作为本发明进一步的改进，所述步骤二中具体步骤是：比较步骤一获得的两个品种svs，筛选五指山猪背最长肌特异性svs。svs共分为四类：一是两个品种位置相同、变异类型相同且变异序列相同的svs；二是两个品种位置相同、变异类型相同但是序列具有差异的svs；三是两个品种序列位置不同的svs；四是两个品种结构变异种类不同的svs。保留第二类、第三和第四类，即五指山猪背最长肌基因位置或变异种类特异性svs，以及五指山猪与大白猪相比，存在序列差异的svs。

40、作为本发明进一步的改进，所述步骤六中具体步骤是：保留步骤四中筛选基因5’utr至3’utr区域内的svs和snps，分别合并五指山背最长肌基因特异性svs及svs区域内snps，即为五指猪背最长肌基因特异性svs和snps标记组合。

41、本发明还提供了上述svs分子标记组合和/或及svs区域内snps分子标记组合在五指山猪的分子标记遗传育种中的应用。

42、相对于现有技术，本发明的有益效果：

43、本发明公开了一种用于检测五指山猪背最长肌基因的特异性svs与svs区域内的snps分子标记组合。本发明筛选的svs本身具有品种特异性，再结合svs区域内snp，表现出更强的特异性和准确性，有利于深入分析突变位点对肌肉生长发育和功能的影响，为基因结构的定向选育提供理论支持。