一种DNA修复酶提取方法与流程

本发明属于生物，具体涉及一种dna修复酶提取方法，更具体涉及聚球藻的培养及dna修复酶提取方法。

背景技术：

1、dna修复酶，也叫dna光修复酶、dna光解酶、光裂合酶等，是一种生物酶，其主要功能是识别并修复dna分子中的损伤，这些损伤可能由紫外线、化学物质等因素引起。在护肤领域，这种酶被用于修复因紫外线照射导致的皮肤细胞dna损伤，其主要作用包括：(1)修复紫外线损伤：直接修复皮肤细胞dna的损伤，减少紫外线引起的皮肤炎症、红斑，降低皮肤癌风险。(2)抗衰老效果：通过修复dna损伤，抑制因损伤导致的代谢异常和免疫功能下降，从而减缓皮肤老化过程，保持皮肤细胞活力。(3)强化皮肤屏障：促进皮肤自我修复，增强皮肤对外界侵害的防御能力。

2、在护肤品中，dna修复酶的来源可能包括通过生物技术手段，如微生物发酵、植物提取或基因工程技术获得的特定微生物、海洋生物或经过基因改造的生物系统。随着科技的发展，寻找更安全、高效的生产方法和可持续的原料来源是这一领域的重要发展方向。

3、文献1(陈璐.南极冰藻dna光修复酶脂质体的研究[d].青岛科技大学,2018.)研究了将来源于南极冰藻(chlamydomonassp.ice-l)的phr-2基因构建入表达载体pet-30a(+)中，并转化到大肠杆菌bl21(de3)中进行高效表达，以获得大量纯化的dna光修复酶。工程菌在特定培养条件下进行诱导表达，表达后的工程菌通过5000rpm离心20分钟进行收集，然后在冰浴条件下使用超声波破碎细胞20分钟，使细胞内容物释放出来。破碎后的细胞提取液经过离心分离，去除不需要的细胞碎片，之后通过sds-page电泳检测提取物中是否有目的蛋白(约66kda)的条带。

4、文献2(曹毅,乔代蓉,白林含,等.盐生杜氏藻cpd光解酶、由其制备的光解酶脂质体及制备方法[p].四川:cn200610021870.2,2008-03-19.)研究了盐生杜氏藻cpd光解酶的制备方法，其首先涉及基因克隆，通过提取总rna并反转录成cdna，利用rt-pcr技术及特异性引物进行扩增，并采用race技术获得全长基因序列。接着，将克隆得到的orf插入到pgex-4t-1表达载体中构建表达载体。然后，将该表达载体转入大肠杆菌，在适宜温度下培养至特定od600值，使用itpg诱导蛋白表达。表达后，收集菌体，通过超声波破碎并离心收集上清液，最后使用gst亲和层析柱对cpd光解酶进行纯化，并进行脱盐处理。

5、文献1和文献2均利用了大肠杆菌作为表达宿主，但大肠杆菌为原核表达系统，可能会限制真核来源的dna修复酶的正确折叠和功能表达，导致活性降低或不完全表达。并且这些方法的制备过程都较为繁琐，增加了实验成本和时间消耗。文献1使用超声波破碎细胞，长时间的超声处理可能引起热效应和蛋白质变性，影响目标酶的活性和完整性。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种dna修复酶提取方法，是一种直接从聚球藻中提取dna修复酶的方法，避免了基因克隆和异源表达的步骤，减少了可能因表达系统限制而导致的活性损失。该方法通过物理破碎和peg相分离技术提取dna修复酶，不仅简化了工艺流程，还尽可能保留了酶的天然构象和活性。

2、本发明所提供的dna修复酶提取方法，包括如下步骤：

3、1)聚球藻的接种

4、2)聚球藻的收获

5、3)聚球藻的破碎

6、对收获的聚球藻进行细胞破碎，离心，收集上清液，得到藻液上清；

7、4)dna修复酶的提取

8、配制peg/pbs溶液，向peg/pbs溶液中加入所述藻液上清，混匀，将所得混合物低温下离心，收集上相，得到含dna修复酶的溶液。

9、上述方法步骤4)中，所述peg的分子量为400-2000，具体可为1000，

10、peg与磷酸盐缓冲溶液(pbs)的配比可为5-15g：32ml，具体可为10g：32ml；

11、peg是一种常用的非离子型相转移剂，有助于在后续步骤中分离蛋白质。pbs是一种常用的缓冲液，能够维持溶液的ph值稳定。

12、使用涡旋混合器将peg和pbs混合均匀，形成双水相体系，用于分离和纯化生物分子。

13、藻液上清与peg/pbs溶液的体积比可为：8ml：25-45ml；

14、所述藻液上清的光密度(od680)为50-100，具体可为90；

15、再次使用涡旋混合器将加入的藻液上清与peg/pbs溶液混合均匀，以确保充分接触和交换。

16、所述离心在4℃的低温条件下进行，离心速度为3000-8000rpm，具体可为3000rpm，离心时间为2-10min，具体可为3min。

17、低温条件有助于保持酶的活性，而离心则有助于分离不同密度的组分。

18、如果需要提取的量较大，可以按照上述比例扩大peg1000和pbs的用量，使用分液漏斗进行混合，然后在4℃下静置一段时间，以促进双水相的形成和分离。静置后得到的上相同样会含有dna修复酶。

19、上述方法步骤1)中，所述聚球藻的接种包括如下步骤：将聚球藻转移到培养基中，摇床培养，待聚球藻进入对数生长期进行扩大培养；

20、其中，所述培养基的组成为：硝酸钠(nano3)1.5g/l，磷酸二氢钾(k2hpo4·3h2o)0.04g/l，硫酸镁七水合物(mgso4·7h2o)0.075g/l，氯化钙二水合物(cacl2·2h2o)0.036g/l，柠檬酸0.006g/l，柠檬酸铁铵0.006g/l，乙二胺四乙酸(edta)0.001g/l，硼酸(h3bo3)0.00286g/l，碳酸钠(na2co3)0.02g/l，氯化锰水合物(mncl2·h2o)0.00181g/l，硫酸锌七水合物(znso4·7h2o)0.000222g/l，硫酸铜五水合物(cuso4·5h2o)0.000079g/l，钼酸钠二水合物(na2moo4·2h2o)0.00039g/l，硝酸钴六水合物(co(no3)2·6h2o)0.000049g/l。

21、所述培养基通过包括如下步骤的方法制备得到：按照培养基的成分浓度称量各种化学成分，将所述化学成分溶解在去离子水中，混合，调整ph至7.0-7.2，灭菌，放置在无菌条件下备用。

22、所述摇床培养的温度为25-30℃，具体可为25℃，摇床的转速设定为100-180rpm，具体可为140rpm，光照强度达到3000lux；

23、所述扩大培养的条件如下：温度为27±1℃，转速为100-180rpm，具体可为140rpm，光照强度达到3000lux。

24、所述扩大培养的时间为7-15d。

25、上述方法步骤2)中，所述聚球藻的收获包括如下步骤：对培养好的聚球藻进行高速离心，弃除上清液，收集底部藻泥，将收集到的藻泥重新悬浮于pbs(磷酸盐缓冲溶液)中，得到聚球藻细胞；

26、其中，所述高速离心的条件为：4000-10000rpm，具体可为8000rpm，持续3-10min，具体可为5min；

27、所述pbs的ph值为7。

28、步骤2)进一步包括调整含有藻泥的pbs溶液使得溶液的光密度(od680)达到大约90的值的操作，od680表示溶液在680纳米波长下的吸光度，用于评估藻类细胞的浓度。通过调节光密度，可以确保获得所需的藻细胞数量。

29、上述方法步骤3)中，所述细胞破碎通过均质机实现，

30、将收获的聚球藻细胞置于均质机中，以物理方法破坏细胞结构。

31、所述均质机的压力为1000-2000巴(bar)，具体可为1400巴(bar)，足以有效破碎聚球藻的细胞壁和细胞膜。

32、所述破碎重复进行多次，具体可为三次；

33、破碎完成后，将处理过的藻液迅速置于4℃的低温条件下，以减缓可能的酶活性损失和其他生化反应；

34、所述离心的条件为12000rpm，持续时间30min，以将破碎后的细胞碎片和未破碎的细胞与含有dna修复酶的上清液分离。

35、所述上清液中含有所需的dna修复酶。

36、由上述方法提取得到的dna修复酶也属于本发明的保护范围。

37、所述dna修复酶的分子量范围为50-70kda。

38、本发明提出了一种dna修复酶的提取方法，该方法针对聚球藻进行操作，旨在简化工艺流程、保留酶的天然构象和活性，同时克服了现有技术中的一些局限性。以下是本发明方案的主要优点：

39、(1)简化工艺流程与降低成本：本发明直接从聚球藻中提取dna修复酶，避开了基因克隆和异源表达的复杂步骤，降低了因表达系统限制可能引发的活性损失，从而简化了整体工艺流程。这不仅减少了实验成本，还缩短了时间消耗，提高了生产效率。

40、(2)提高酶活性与保持天然构象：通过物理破碎和peg(聚乙二醇)/pbs(磷酸盐缓冲溶液)相分离技术，该方法能有效提取dna修复酶，同时尽可能保持了酶的天然构象和活性。相比超声波破碎细胞可能导致的热效应和蛋白质变性问题，这种方法更为温和，有利于保护酶的结构和功能。

41、(3)提高提取效率与纯度：使用peg相分离技术是一种有效的蛋白质纯化手段，通过形成双水相体系，可以高效地分离和纯化生物分子，尤其是dna修复酶，且不影响酶的活性。这种方法相比传统的亲和层析等纯化手段，可能更加简便快捷，且能较好地回收目标产物。

42、(4)环境友好与可持续性：本发明的方法使用了自然来源的聚球藻，直接从微生物中提取，避免了复杂的基因工程操作，相对于基因工程技术获得的微生物或海洋生物，更加安全、环保，符合可持续发展的理念。