富含核糖的拟微球藻多糖及其制备方法和作为益生元的应用

本发明涉及医药生物，具体涉及一种富含核糖的拟微球藻多糖的制备、纯化、结构鉴定及其调节肥胖导致的肠道屏障损伤的研究。

背景技术：

1、随着“海洋强国”和“双碳”战略目标的确立，微藻因其高营养价值和固碳率备受关注，成为国际上公认的增进全民健康和发展低碳食品的新型原料。此外，微藻因富含营养功能成分而展现出强大的市场发展潜力。但微藻的综合利率低和营养功能挖掘不足，限制了相关产品开发，阻碍了微藻商业化发展。因此，微藻营养功能挖掘对于实现海洋食品绿色低碳发展至关重要。

2、肠道屏障在维持人体健康方面发挥着重要作用，肠道屏障功能障碍促进疾病的发生发展。《中国居民营养与慢性病状况报告(2020)》表明，居民膳食脂肪供能比持续上升。过量的脂肪摄入易导致肠道屏障功能障碍，增加肥胖、2型糖尿病、肝脂肪变性等慢性疾病的易感性。我国因慢性病导致的死亡占总死亡88.5％，防控工作仍面临巨大的挑战。因此，靶向调节肠道屏障功能在慢性疾病防治和人体健康维持方面有重要需要。

3、多形拟杆菌是人类肠道中最丰富的共生益生菌，通常在健康人体的肠道中存在，对于调控人类肠道健康具有巨大潜力。研究显示多形拟杆菌及其产物能通过维持肠道稳态修复宿主肠道屏障。然而，多形拟杆菌是革兰氏阴性菌，因其外壁层的脂多糖有致人体发热的潜在危害而无法直接食用。因此，靶向调节多形拟杆菌的丰度是保护肠道屏障功能的有效手段。cell host&microbe研究发现，核糖在调控肠道菌群结构方面发挥重要作用。与其他单糖相比，核糖通过靶向诱导核糖利用系统(ribose utilization systems，rus)的表达赋予细菌竞争优势，进而增加多形拟杆菌(bacteroides thetaiotaomicron)在肠道中的定殖。但最新研究表明，长期大量摄入核糖单体会诱发抑郁症。因此，富含核糖的天然营养成分的挖掘是改善肠道屏障功能的有效策略。

4、拟微球藻是一种单细胞微藻资源，2021年被我国列为新资源食品，拟微球藻中富含脂质、蛋白质、多糖及矿物质。目前我国拟微球藻的应用以提取油脂为主，对于脱油后的藻渣主要用于动物饲料，附加值较低，综合利用率低。本发明研究团队前期研究表明，拟微球藻藻渣含大量多糖，通过改进多糖的分离技术，研究团队成功分离出一种富含核糖的多糖-拟微球藻多糖，通过进一步的功能研究发现，拟微球藻多糖能够提高肥胖小鼠肠道中多形拟杆菌的丰度并显著减轻体重增加。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是：提供一种富含核糖的拟微球藻多糖的制备、纯化、结构鉴定及其调节肥胖导致的肠道屏障损伤的研究。

2、现有的研究表明，大部分海藻多糖不含或仅含有微量核糖，而本发明发现拟微球藻多糖中富含核糖(60.24mass％)，并能显著改善高脂饮食引起的小鼠肠道屏障损伤和肥胖。

3、为解决上述技术问题，即从拟微球藻中分离出富含核糖的拟微球藻多糖，本发明采用的技术方案是：

4、本发明前处理采用高压微射流辅助热水浸提乙醇沉淀的方法从拟微球藻中提取总多糖，采用sevag法除蛋白，并进行透析、冷冻干燥得到拟微球藻多糖粗提物。并进一步采用deae纤维素阴离子色谱柱法纯化多糖得到纯化拟微球藻多糖nps。

5、目前现有技术中，关于多糖提取的报道比较多，其中关于球藻多糖提取的专利，典型的申请有：

6、中国专利cn116396864a公开了一种具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法和应用，通过对微拟球藻进行超低温冻存，使用超声辅助提取和酸提法对海藻多糖进行粗提。

7、中国专利cn113584102a公开了一种具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法，通过超声波—微波—酶法协同提取微拟球藻内多糖，

8、中国专利cn114027510a公开了一种蛋白核小球藻多糖混合物及其制备方法和作为新型益生元的应用，使用蛋白核小球藻干粉，利用热水浸提或加木瓜蛋白酶酶解处理获得提取液。

9、与现有技术相比，本发明前处理采用高压微射流辅助热水浸提乙醇沉淀的方法，可以最大限度的提高多糖提取率，尤其是对核糖的提取；高压微射流是在超高压压力作用下，经过孔径很微小的阀心，产生几倍音速的流体，从而达到分散，均质，乳化，纳米颗粒等等，目前采用高压微射流辅助热水浸提乙醇沉淀的鲜有报道。

10、具体的，本发明提供一种富含核糖的拟微球藻多糖纯化产物(nps)的方法，具体包括如下步骤：

11、步骤一、脱脂拟微球藻藻渣与去离子水以不同的比例(1:10-1:3)制备成悬液，通过高压微射流采用不同的压力(0、60、100、140和180mpa)和不同循环次数(1、3和5次)处理，80℃浸提不同时间(0.5、1、2和3h)，3000-5000g离心10-25min，收集上清液，即为拟微球藻多糖粗提液；

12、步骤二、往提取液中加入乙醇使提取物沉淀得到多糖提取物；

13、步骤三、将沉淀物以1:3-1:10比例复溶于水制成均匀悬液，将悬液与sevage试剂[氯仿:正丁醇＝5:1(v/v)]以5:1比例混合，振荡，离心，除去混合物中的蛋白；

14、步骤四、1000-8000da透析袋透析24-72h除多糖中小分子杂质；

15、步骤五、透析液于-50℃冷冻干燥48-72h到拟微球藻多糖粗提物；

16、步骤六、将粗多糖粗溶于去离子水制成浓度为10mg/ml的粗多糖溶液，使用0.45微米的水系微孔滤膜过滤。随后，将多糖溶液注入deae纤维素阴离子交换柱层析，依次用去离子水、0.1/0.3/0.5/0.7/0.9和1m的nacl梯度洗脱，使用自动收集器收集多糖含量最多的分离液；

17、步骤七、上述分离液以去离子水为洗脱液使用sephadex g-100凝胶柱进一步纯化。

18、步骤八、1000-8000da透析袋透析24-72h后于-50℃冷冻干燥48-72h得到拟微球藻多糖纯化产物nps。

19、在上述技术方案中，在步骤一中，取拟微球藻脱脂藻粉溶于去离子水制成0.2g/ml的悬液，使用高压微射流于100mpa循环3次，再将其置于85℃提取0.5h，冷却至室温后离心取上清。

20、在上述技术方案中，在步骤二中，加入95％的乙醇体积为上清液体积的3倍。

21、申请人前期利用水提法从企业油脂提取后的藻渣中制备了拟微球藻粗多糖，主要含有核糖、葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖和半乳糖等单糖。值得注意的是，拟微球藻粗多糖的核糖含量高于40％，可能是由于大量的核糖代谢相关的酶参与藻的光保护机制。多形拟杆菌及其产物能通过维持肠道稳态修复宿主肠道屏障。然而，多形拟杆菌是革兰氏阴性菌，因其外壁层的脂多糖有致人体发热的潜在危害而无法直接食用。因此，靶向调节多形拟杆菌的丰度是保护肠道屏障功能的有效手段。与其他单糖相比，核糖通过靶向诱导核糖利用系统(ribose utilization systems，rus)的表达赋予细菌竞争优势，进而增加多形拟杆菌在肠道中的定殖。因此，富含核糖的天然营养成分的挖掘是改善肠道屏障功能的有效策略。以上结果提示，脱脂拟微球藻藻渣中富含核糖的多糖具有诱导多形拟杆菌rus表达、促进多形拟杆菌定殖的潜力。

22、然而，传统水提法提取多糖时存在耗时长和提取率低的缺点。此外，微藻具有较厚的细胞壁还会阻碍多糖的释放，高压微射流技术利用超高速射流对撞产生强烈的剪切力可破坏细胞壁，故此技术可用于微藻类破碎，提高内容物溶出率。因此本发明拟利用高压微射流辅助提取拟微球藻多糖，此外，前期研究发现，拟微球藻粗多糖可改善高脂膳食小鼠的肠道屏障渗透性(详见说明书附图6)。同时，拟微球藻粗多糖能够改善小鼠的肠道菌群结构，增加拟杆菌属bacteroides spp.的相对丰度。拟杆菌属有显著变化，提示拟微球藻粗多糖可能可以调节多形拟杆菌(bacteroides thetaiotaomicron)。综上，拟微球藻多糖是一种极具潜力的保护肠道屏障功能的益生元，其保护肠道屏障功能的活性是否通过靶向调节多形拟杆菌尚需进一步研究。

23、根据以上前期研究基础，我们提出以下科学假说：拟微球藻多糖介导多形拟杆菌及其代谢产物核糖-5-磷酸促进肠上皮细胞增殖；拟微球藻多糖靶向调节多形拟杆菌的rus表达促进其增殖。

24、本发明的主要研究思路如下：(1)采用高压微射流辅助从脱油藻渣中高效提取富含核糖的拟微球藻多糖；(2)研究肠道屏障功能、结肠中多形拟杆菌丰度及rus关键基因水平、核糖-5-磷酸水平、结肠细胞增殖情况、参与细胞增殖相关基因表达，探究拟微球藻多糖介导多形拟杆菌改善肠道屏障损伤的效果；(3)研究拟微球藻多糖对多形拟杆菌生长动力学影响，明确多形拟杆菌对拟微球藻多糖的利用水平；(4)研究拟微球藻多糖对多形拟杆菌rus关键基因(rusgh、rusk1、rusk2和rust)的表达影响和拟微球藻多糖对基因敲除菌株生长状况的影响，明确多形拟杆菌利用拟微球藻多糖的途径；最终揭示拟微球藻多糖介导多形拟杆菌及代谢产物(核糖-5-磷酸)改善肠道屏障功能。本发明将为拟微球藻的开发和利用提供理论依据，为精准调控肠道健康提供新思路。

25、本发明的有益效果：

26、1、本发明首次发现海藻多糖及拟微球藻多糖的单糖组成中核糖含量最高。

27、本发明制备的拟微球藻多糖nps的单糖组成中不同于其它藻类多糖，不含核糖或者含有很少量核糖，本拟微球藻多糖中核糖占比最高，而核糖能够靶向诱导拟杆菌的核糖利用系统(rus)赋予肠道竞争性优势，具有潜在益生元的作用。

28、2、本发明拟微球藻多糖nps能够缓解高脂饮食导致的肥胖，能够改善肥胖引起的肠道屏障损伤、改善肠道菌群失衡，增加益生菌bacteroides、akkermansia、ligilactobacillus、bifidobacterium的相对丰度。

29、以核糖为主的拟微球藻多糖能够缓解小鼠高脂饮食引起的肥胖，调节肥胖引起的肠道屏障受损及肠道菌群紊乱，具有潜在益生元的开发价值。先前研究发现海藻多糖多以葡萄糖或甘露糖为主要成分，很少或几乎不含有核糖，本发明首次发现拟微球藻多糖以核糖为主要成分。