永生化人成纤维细胞来源外泌体的制备方法、外泌体及其应用

本发明涉及生物，具体涉及一种永生化人成纤维细胞来源外泌体的制备方法、外泌体及其应用。

背景技术：

1、外泌体是由细胞内多泡体与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的膜性囊泡。几乎所有类型的细胞，都可以产生并释放外泌体。它是一种直径为30-100nm的纳米级脂质包裹体结构，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。内部包裹了蛋白、mrna和microrna等物质。外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳，被分泌出的外泌体会进入血液、唾液、尿液、及乳汁等体液中，通过循环系统到达其他细胞与组织，产生远程调控作用。

2、目前，源自间充质干细胞的外泌体作为间充质干细胞的替代品，用于新的无细胞治疗策略，已被应用于多种疾病模型中。这些疾病模型包括神经疾病、心血管疾病、免疫疾病、肾脏疾病、肌肉骨骼疾病、肝脏疾病、呼吸系统疾病、眼部疾病、皮肤病，以及癌症和衰老相关的慢性病等。然而，间充质干细胞外泌体的产业化仍面临许多挑战，例如间充质干细胞的大规模培养、高质量和规模化生产等。

3、此外，有研究显示，源自年轻原代细胞的外泌体在减少细胞氧化损伤、治疗或缓解老年疾病等领域具有显著效果，但原代细胞的培养同样面临着原代细胞存活的问题。

技术实现思路

1、为了解决背景技术中存在的问题，本发明提供了一种永生化人成纤维细胞来源外泌体的制备方法、外泌体及其应用。

2、本发明采用的技术方案是：

3、(一)一种永生化人成纤维细胞的应用

4、所述应用为用于提取制备永生化人成纤维细胞来源外泌体。

5、(二)一种永生化人成纤维细胞来源外泌体的制备方法

6、所述制备方法包括如下步骤：

7、s1)接种永生化人成纤维细胞，用含有10％胎牛血清的dmem细胞培养基培养；

8、s2)当永生化人成纤维细胞的密度达到50％～60％时，改用不含胎牛血清的dmem细胞培养基，培养48～72小时后，收集上清液；

9、s3)使用过滤器过滤所述步骤s2)收集到的上清液后，取滤液，在温度为3～5℃、转速为18000～22000xg的条件下将滤液离心20～40分钟后，取离心后的上清液，在温度为3～5℃、转速为90000～110000xg、离心时间为60～80分钟的条件下将离心后的上清液离心两次并收集沉淀，获得的沉淀为所述的永生化人成纤维细胞来源外泌体。

10、所述步骤s3)中，所述过滤器的规格为0.22μm。

11、所述步骤s1)中，所述永生化人成纤维细胞的制备方法包括如下步骤：

12、(1)使用pbabe-puro-htert质粒转染293t细胞，生成目的病毒颗粒；

13、(2)将所述目的病毒颗粒转染原代人成纤维细胞，得到转染的人成纤维细胞；

14、(3)通过筛选得到转染成功的永生化人成纤维细胞。

15、(三)一种外泌体

16、所述外泌体由上述永生化人成纤维细胞来源外泌体的制备方法制备得到。

17、(四)一种外泌体的应用

18、所述外泌体能够用于药物的制备或筛选。

19、具体地，所述药物为用于改善或治疗老年疾病的药物、用于促进皮肤愈合的药物或者用于治疗炎症性皮肤疾病的药物。

20、所述外泌体还能够用于医用材料或医疗美容用材料的制备。

21、本发明的有益效果体现在：

22、(1)本发明采用永生化人成纤维细胞制备外泌体，作为外泌体的来源，永生化人成纤维细胞与间充质干细胞或原代细胞相比，易于制备及进行工程化处理、培养成本低廉、多次传代后仍能产生外泌体，更适用于大规模培养并实现外泌体的工业化生产。

23、(2)本发明方法制备得到的永生化人成纤维细胞外泌体具有能够促进细胞迁移、良好的细胞修复能力、延长端粒、增强细胞增殖能力、抵抗氧化损伤、抗凋亡等功能，可用于相关疾病的治疗药物的制备或筛选。

技术特征：

1.一种永生化人成纤维细胞的应用，其特征在于：用于制备永生化人成纤维细胞来源外泌体。

2.一种永生化人成纤维细胞来源外泌体的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的一种永生化人成纤维细胞来源外泌体的制备方法，其特征在于：所述步骤s3)中，所述过滤器的规格为0.22μm。

4.根据权利要求2所述的一种永生化人成纤维细胞来源外泌体的制备方法，其特征在于：所述永生化人成纤维细胞的制备方法包括如下步骤：

5.一种外泌体，其特征在于：所述外泌体由如权利要求2～4任一所述的制备方法制备得到。

6.一种如权利要求5所述的外泌体的应用，其特征在于：所述应用为用于药物的制备或筛选。

7.根据权利要求6所述的一种外泌体的应用，其特征在于：所述药物为用于改善或治疗老年疾病的药物、用于促进皮肤愈合的药物或者用于治疗炎症性皮肤疾病的药物。

8.一种如权利要求5所述的外泌体的应用，其特征在于：所述应用为用于医用材料或医疗美容用材料的制备。

技术总结本发明公开了一种永生化人成纤维细胞来源外泌体的制备方法、外泌体及其应用。本发明制备了永生化人成纤维细胞并将其用于制备外泌体，外泌体的制备过程包括：用含有10％胎牛血清的DMEM细胞培养基培养永生化人成纤维细胞至密度为50％～60％，用无血清的DMEM细胞培养基继续培养48～72小时后收集上清液，从上清液中分离得到外泌体；其中，永生化人成纤维细胞是通过使用pBABE‑puro‑hTERT表达载体的病毒颗粒转染人成纤维细胞，用嘌呤霉素筛选后获得的。本发明方法制得的外泌体，具有能够促进细胞迁移、良好的细胞修复能力、延长端粒、增强细胞增殖能力、抵抗氧化损伤、抗凋亡、延缓细胞衰老等功能，具有广泛的应用前景。技术研发人员：孙琳琳,盛赵莹,刘洋受保护的技术使用者：浙江大学医学院附属第一医院（浙江省第一医院）技术研发日：技术公布日：2024/8/1