一种三维睑板腺细胞微球仿生培养方法及获得的睑板腺类器官

一种三维睑板腺细胞微球仿生培养方法及获得的睑板腺类器官，属于仿生培养和类器官领域

背景技术：

1、干眼症，指由于泪液量或质的异常引起泪膜不稳定和眼表损害，从而导致眼不适症状的一类疾病。我国干眼症发病率高达21％～30％，估计至少3亿人患病。睑板腺功能障碍(meibomian gland dysfunction，mgd)被公认为引起全世界范围内蒸发型干眼的最主要病因。mgd是一种慢性、弥漫性的睑板腺异常，通常以终末导管阻塞和/或腺体分泌物改变为特征，引起泪膜成分改变、泪液水样层蒸发增强、眼表渗透压升高并损害眼表健康。然而，造成mgd的病因复杂多样，且尚未研究透彻，治愈及对因治疗难度大，只能通过物理办法或对症药物进行改善。

2、仿生细胞培养是目前的前沿技术，致力于通过工程方法在体外为细胞创造仿生微环境。与传统的平板细胞培养相比，它可以为疾病建模、药物开发和再生医学提供更精确的平台。原代睑板腺细胞培养非常困难，且人类正常睑板腺组织样本极难获得，因此想要建立睑板腺细胞长期培养体系存在巨大挑战，也是突破目前mgd致病机制和对因治疗亟待解决的关键问题。大量研究尝试通过改变培养条件(缺氧、气-液界面)或添加补充剂(胰岛素、罗格列酮、阿奇霉素等)来调节睑板腺细胞的分化和促进脂质积累，但其组成与人类睑板腺脂质差异巨大，且有可能建立睑板腺细胞的终末分化和全分泌状态，加速细胞程序性死亡。三维仿生培养通过模拟与体内生理状态微环境来建立更全面的细胞-细胞和细胞-基质的相互作用。有研究建立了基于膜和支架的三维-ihmgec培养体系，发现ihmgec在三维培养体系中可以实现更长期稳定的脂质积累。近来，三维打印和微流控技术为整合新兴仿生细胞培养策略(例如微载体、球体和类器官)、创建更复杂和更精确的仿生结构提供了有力的平台。因此，借助新型生物制造集成技术和平台，精确调节化学和物理信号模拟睑板腺生理微环境，建立三维睑板腺类器官仿生培养体系，有望实现在体外诱导生理睑板腺相似的基因表达和脂质积累模式，对睑板腺衰老及年龄相关性mgd临床治疗具有重要意义。

3、目前现有技术存在的睑板腺细胞的三维培养是通过将细胞接种在多孔支架或者基质胶(如参考文献selikem nuwormegbe,et al.“induction of meibocytedifferentiation by three-dimensional,matrigel culture of immortalized humanmeibomian gland epithelial cells to form acinar organoids”,oculsurf.2022october；26:271–282)中，靠单个细胞增殖形成一个球体，早期细胞增殖非常缓慢(如文献中需3周才能形成直径100μm左右的球体，后续药物刺激还需要额外培养1周)，形成的球体大小会非常不均一(如参考文献图2)；当细胞球直径越来越大时，处于内部的细胞会因为营养交换出现凋亡；文献中需要使用一些激动剂(罗格列酮)去促进细胞分化，这个过程会加速细胞全分泌或者细胞死亡。这种体外培养方式很难作为疾病细胞模型用于后续机理、药物等研究。

4、综上所述，目前简单的二维平板培养与体内睑板腺细胞组成和微环境相比依然存在巨大的差距，不能反应真实眼表睑板腺多细胞类型生理环境；而现存的三维培养又存在着培养周期长，需要额外添加激动剂以及培养的类器官球体大小不均一等缺陷，因此，开发适用于干眼病因机制挖掘、药物筛选、睑板腺损伤再生的更复杂、更具生物相关性的体外三维睑板腺仿生培养体系是目前眼表疾病急需解决的问题之一。

技术实现思路

1、为了解决上述至少一个问题，本发明提供了一种三维睑板腺类器官仿生培养方法，所述的方法包括如下步骤：

2、1)制备仿睑板腺外基质微环境的仿生凝胶微球；

3、2)制备睑板腺腺体上皮细胞悬液，或制备睑板腺腺体上皮细胞与导管上皮细胞的混合细胞悬液；

4、3)将步骤2)细胞悬液与步骤1)的仿生凝胶微球混合均匀加入至低吸附培养板；

5、4)加入增殖培养基培养得到所述三维睑板腺类器官。

6、在本发明的一种实施方式中，步骤1)所述的仿睑板腺外基质微环境的仿生凝胶微球直径为50-200微米。

7、在本发明的一种实施方式中，步骤1)所述的仿生凝胶微球由甲基丙烯酸化的硫酸软骨素和甲基丙烯酸化的明胶配制而成的混合溶液并通过光引发剂交联制备而成；优选的，所述的甲基丙烯酸化的硫酸软骨素和甲基丙烯酸化的明胶浓度均为5％，质量比例为1:10～1:5；优选的，甲基丙烯酸化的硫酸软骨素和甲基丙烯酸化的明胶充分混合后加入引发剂作为离散相，制备含有表面活性剂十二烷基硫酸钠的液体石蜡作为连续相，通过负压泵送的驱动方式，使离散相和连续相通过液滴生成微流控装置，形成大小均一，尺寸可控的微液滴；通过集成的光固化装置在405nm可见光照射下发生交联反应，自发形成仿睑板腺细胞外基质的仿生凝胶微球；优选的，所述的引发剂为浓度0.05％苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(lap)。

8、在本发明的一种实施方式中，步骤1)仿生凝胶微球的使用量为1-2mg/孔；所述的细胞加入量为1～2×105/孔。

9、在本发明的一种实施方式中，所述的混合细胞悬液由睑板腺功能细胞腺体上皮细胞和导管上皮细胞混合而成。

10、在本发明的一种实施方式中，所述的睑板腺腺体上皮细胞和导管上皮细胞为睑板腺细胞系或原代细胞，来源包括人、新西兰大白兔、大鼠或小鼠中的任意一种。

11、在本发明的一种实施方式中，所述的细胞悬液中总睑板腺细胞的总浓度为1.2×105/ml。

12、在本发明的一种实施方式中，所述的混合细胞悬液中睑板腺腺体上皮细胞和导管上皮细胞的浓度百分比为10:1～2:1。

13、在本发明的一种实施方式中，所述培养板为低吸附24孔培养板。

14、在本发明的一种实施方式中，所述低吸附孔板中每孔加入细胞悬液和仿生微球混合溶液，其比例为1ml/1～2mg，使其自发形成睑板腺细胞微球。

15、在本发明的一种实施方式中，所述的细胞培养液为睑板腺细胞专用增殖培养基，由角质细胞无血清培养基，添加10～20mg/ml牛脑垂体提取物、20～30μg/ml表皮生长因子、50～150u/ml青霉素及0.05～2mg/ml链霉素配制而成。

16、本发明的第二个方面是提供第一方面所述的方法获得的三维睑板腺类器官。

17、本发明的有益效果包括：

18、1)本发明将睑板腺腺体上皮细胞、导管上皮细胞进行三维仿生培养，模拟人体睑板腺2种重要功能细胞的生长模式与脂代谢功能，相比二维贴壁培养，细胞可以更全面地与培养基质和邻近细胞产生相互作用；制备的凝胶微球通过优化获得与生理睑板腺细胞外基质相似的理化性能，使得本发明所构建的三维仿生培养体系更加接近体内的组织环境，可为后续干眼机制与治疗研究、睑板腺损伤修复研究提供更准确、可靠的模型。

19、2)本发明构建的三维睑板腺类器官仿生培养体系，相比动物模型，操作流程更加方便，实验周期缩短，具有更高的可重复性和可靠性。