基于超声辅助多物理场耦合的小细胞外囊泡的制备方法与流程

本发明涉及生物材料，尤其涉及基于超声辅助多物理场耦合的小细胞外囊泡的制备方法。

背景技术：

1、外泌体是一种细胞外囊泡，它们目前被认为是有潜力的检测生物标志物和生理信号递送载体。根据起源细胞的不同，它们可以包含细胞的许多成分，包括dna、rna、脂质、代谢物以及胞质和细胞表面蛋白。它们递送到受体细胞中的蛋白质、代谢物和核酸可有效改变其生物反应，这种以复杂途径调节细胞生命活动的内在特性提高了它们在许多疾病的治疗控制中的潜在效用。目前已有超过100项临床试验验证了人间充质干细胞分泌的小细胞外囊泡在治疗多种疾病方面的功效，如心血管疾病、急性肾损伤、脊髓损伤和糖尿病等。此外，它们还可以促进胶原蛋白的合成，延缓皮肤衰老；增强内皮细胞的成纤维细胞增殖、迁移和血管生成活性，促进皮肤再生和修复；介导细胞间通讯，抑制胶原蛋白沉积，治疗疤痕增生。大量实验结果表明了来源于干细胞的小细胞外囊泡在医疗美容应用中的巨大潜力。

2、然而，小细胞外囊泡的应用通常受到其在常规培养条件下，即直接使用培养皿对细胞进行培养时供体细胞分泌量低的限制，对于间充质干细胞来说尤其如此，提高功能性小细胞外囊泡的产量仍然具有挑战性。目前，已有一些研究者基于物理刺激技术来增加小细胞外囊泡的分泌量，例如激光照射、超声刺激、电场刺激、机械湍流等，然而这些技术通常需要昂贵且笨重的设备，并且可能导致细胞活力受损；此外，还有研究者采用调节细胞外微环境刚度的方式增加小细胞外囊泡的分泌，但尚未有调节多种物理场共同作用来增加小细胞外囊泡分泌的尝试。

3、生物电是生命系统不可或缺的一部分，目前已经开发了使用外部设备或电极对生命体或组织进行电疗的技术，但外加电源的复杂和不便使相关技术存在各种问题，植入电极可能会带来重大的感染风险，侵入性去除程序也会对组织和细胞造成破坏。

4、具有力-电转化特性的生物材料(压电生物材料)是一类特定的智能材料，它们可以将机械刺激转化为电信号，实现机械能到电能的转化，无需施加任何外加电压。目前应用最为广泛的压电生物材料如压电陶瓷、压电聚合物等材料，虽然拥有更高的压电常数，但是具有成本较高和制备工艺较为复杂的局限性；由于它们的超疏水性能和可能存在的细胞毒性，在细胞培养中仍然存在一系列限制和挑战。然而，这些材料的安全性和降解副产物尚未得到充分的确立或验证，无法在人体内或者体外的细胞培养中长期使用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供一种基于超声辅助多物理场耦合的小细胞外囊泡的制备方法，利用超声声压激发多物理场之间的耦合效应，从而促进细胞与其周围环境之间的复杂相互作用。这种相互作用的结果导致细胞分泌小细胞外囊泡的能力显著提升，进而为细胞与其微环境之间的信息传递和调节提供了更为精细和高效的机制，为开发新型生物医学应用和治疗策略提供了有力的科学基础。

2、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

3、本发明的第一目的是提供一种基于多物理场耦合小细胞外囊泡的制备方法，包括取细胞接种至多物理场耦合水凝胶，经培养后获得细胞外泌体；所述多物理场耦合水凝胶为内部掺杂有纳米纤维切片的i型胶原蛋白三维胶；所述多物理场耦合水凝胶的制备过程为以聚-l-乳酸为原料，氯仿为溶剂，采用静电纺丝工艺制备得到的纳米纤维毡，所述多物理场耦合水凝胶的纳米纤维长度为20～30μm。

4、进一步的，所述多物理场耦合水凝胶中纳米纤维切片的质量百分比不低于20％。

5、进一步的，所述多物理场耦合水凝胶的制备过程具体如下：按质量体积比为(1～3.5)g：20ml，将1g聚-l-乳酸溶解在20ml氯仿中过夜，在5～25kv下使用g22针以1～5ml/h的流速旋转溶液，并收集在2000～6000rpm的滚筒上，得到纳米纤维垫。

6、进一步的，将纳米纤维切片与i型胶原蛋白混合，在细胞培养皿中静置10～12min固化，得到内部掺杂有纳米纤维切片的i型胶原蛋白三维胶。

7、进一步的，所述纳米纤维切片与所述i型胶原蛋白的质量比为1:4，能较好兼顾刚度及压电特性。

8、进一步的，所述i型胶原蛋白为鼠源i型胶原蛋白。

9、进一步的，所述接种后的多物理场耦合水凝胶经完全培养基培养后换用无血清培养基培养，获得所述小细胞外囊泡。

10、进一步的，所述细胞包括人间充质干细胞。

11、进一步的，所述多物理场耦合水凝胶的多物理场耦合包括外基质刚度调节、原位电信号刺激、离子跨膜运输调控或无线信号的调节中的至少一种。

12、本发明的第二目的是提供采用上述制备方法制备得到的小细胞外囊泡。

13、进一步的，所述细胞外泌体的粒径大小为50～200nm。

14、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

15、(1)本发明提供的基于多物理场耦合的小细胞外囊泡的制备方法，包括取细胞接种至多物理场耦合水凝胶，经培养后获得小细胞外囊泡；多物理场耦合水凝胶以i型胶原蛋白为基体，与聚l乳酸纳米纤维切片复合。利用超声声压激发多物理场之间的耦合效应，调控细胞与多物理场耦合水凝胶之间的相互作用，大幅提升细胞分泌小细胞外囊泡的能力，同时不降低小细胞外囊泡质量，从而实现高效的小细胞外囊泡生产。

16、(2)本发明提供的多物理场耦合水凝胶可实现外基质刚度调节、原位电信号刺激、离子跨膜运输调控或无线信号的调节。

17、(3)多场耦合细胞培养平台制造成本低廉，单次费用在百元以内，优势明显。

18、(4)可实现灵活可操控的平台搭建，适用多种不同需求和应用场景。

19、(5)本产品除了成本方面的优势，也能同时满足高效和便捷的特点。

20、(6)多场耦合培养细胞对于细胞的刺激具有高效、原位、实时、无线等特点。同时兼顾细胞培养的便利性与小细胞外囊泡的高产率，有广泛应用前景。

技术特征：

1.一种基于超声辅助多物理场耦合细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括取细胞接种至多物理场耦合水凝胶，进行培养，培养过程中对接种后的多物理场耦合水凝胶按0.1～0.6w/cm2提供10～60khz超声刺激，获得细胞外泌体；所述多物理场耦合水凝胶为内部掺杂有纳米纤维切片的i型胶原蛋白三维胶；所述纳米纤维切片为以聚-l-乳酸为原料，氯仿为溶剂，采用静电纺丝工艺制备得到的纳米纤维垫，然后将纳米纤维垫切割成长度为20～30μm得到的。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述多物理场耦合水凝胶中纳米纤维切片的质量分数不低于20％。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述多物理场耦合水凝胶的制备过程具体如下：按质量体积比为(1～3.5)g：20ml，将1g聚-l-乳酸溶解在20ml氯仿中过夜，在5～25kv下使用g22针以1～5ml/h的流速旋转溶液，并收集在2000～6000rpm的滚筒上，得到纳米纤维垫。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，将纳米纤维切片与i型胶原蛋白混合，在细胞培养皿中静置10～12min固化，得到内部掺杂纳米纤维切片的i型胶原蛋白三维胶。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述纳米纤维切片与所述i型胶原蛋白的质量比为1:4。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述i型胶原蛋白为鼠源i型胶原蛋白。

7.如权利要求1-6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述接种后的多物理场耦合水凝胶经完全培养基培养后换用无血清培养基培养，获得所述细胞外泌体。

8.如权利要求1-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述细胞包括人间充质干细胞。

9.一种采用如权利要求1-8中任一项所述的制备方法制备得到的细胞外泌体。

10.如权利要求9所述的细胞外泌体，其特征在于，所述细胞外泌体的粒径大小为50～200nm。

技术总结本发明提供了基于超声辅助多物理场耦合的小细胞外囊泡的制备方法，属于生物材料技术领域。包括取细胞接种至多物理场耦合水凝胶，培养过程中对接种后的多物理场耦合水凝胶按0.1～0.6W/cm<supgt;2</supgt;提供10～60Khz超声刺激，经培养后获得小细胞外囊泡；多物理场耦合水凝胶为内部掺杂有纳米纤维切片的I型胶原蛋白三维胶，多物理场耦合水凝胶为以聚‑L‑乳酸为原料，氯仿为溶剂，采用静电纺丝工艺制备得到的纳米纤维毡，多物理场耦合水凝胶的纳米纤维长度为20～30μm，利用超声声压激发多物理场之间的耦合效应，调控细胞与多物理场耦合水凝胶之间的相互作用，大幅提升细胞分泌小细胞外囊泡的能力，同时不降低小细胞外囊泡质量，从而实现高效的小细胞外囊泡生产。技术研发人员：王晨,张舒欣,丁柱受保护的技术使用者：深圳市力新创生物技术有限公司技术研发日：技术公布日：2024/8/1