一种生物合成β-紫罗兰酮的菌株及方法与流程

本发明属于生物合成领域，特别涉及一种生物合成β-紫罗兰酮的菌株及方法。

背景技术：

1、β-紫罗兰酮作为食品行业中使用的一种香精香料添加剂，在烟草香精香料领域也被广泛应用。β-紫罗兰酮具有类似紫罗兰花和柏木香气，且具有很低的香气阈值(空气中0.007ppb，水中为1ppb)，因此在卷烟香精香料技术中被大量使用。目前，为降低烟草制品的危害，各国烟草企业竭力降低卷烟烟气中焦油的含量，这导致卷烟烟气的香味明显不足，难以满足消费者对香味的要求，这就需要用香精香料加以弥补，随之对β-紫罗兰酮的需求量也逐渐增多。

2、为满足市场对β-紫罗兰酮日益增长的需求，合成生物学为β-紫罗兰酮的环境友好的高效合成提供了新思路，beekwilder等人首次在产β-胡萝卜素的酿酒酵母中异源表达ccds来合成β-紫罗兰酮，他们将β-胡萝卜素合成基因crtyb、crti、crte以及thmg1及在酿酒酵母中表达，获得了产β-胡萝卜素的菌株；然后异源表达类胡萝卜素双加氧裂解酶riccd1，所得重组酿酒酵母产生了0.22mg/g dcw的β-紫罗兰酮。lopez等过表达β-胡萝卜素生物合成途径中的限速酶thmgr1、bst1、crtyb、crti以及矮牵牛来源的ccd1，在摇瓶条件下β-紫罗兰酮产量为0.62mg/gdcw，分批补料发酵产量为1mg/g dcw(5mg/l)。于洪巍等在高产β-胡萝卜素的酿酒酵母中同时过表达玫瑰和拟南芥来源的rdccd1和atccd7，摇瓶条件下两相发酵产6.2mg/l的β-紫罗兰酮。

3、但现有技术采用酿酒酵母生产β-紫罗兰酮的主要瓶颈是ccd酶的活性不高和前体异戊烯基焦磷酸匮乏，限制了β-紫罗兰酮产量的提高。

4、本发明旨在解决上述问题中的至少一个。

技术实现思路

1、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

2、为解决上述技术问题，本发明提供了一种合成β-紫罗兰酮的菌株及方法，以解脂耶氏酵母po1f(yarrowialipolyticapo1f)为出发菌株，通过异源表达β-紫罗兰酮合成相关基因构建了β-紫罗兰酮新的生物合成方案，通过过表达甲羟戊酸途径相关基因强化了解脂耶氏酵母内源甲羟戊酸途径，以此大幅度提升了β-紫罗兰酮产量。这里所述β-紫罗兰酮合成相关基因为如seq id no.1所示的编码香叶基香叶基二磷酸合酶基因ggpps、seq idno.2所示的编码双功能八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶基因mccrtyb、seq id no.3所示的编码番茄红素合酶基因btcrti和seq id no.4编码类胡萝卜裂解双加氧酶基因phccd1；所述甲羟戊酸途径相关基因为seq id no.5所示的编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因thmg1、seq idno.6异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi和seq id no.7所示的编码法尼基焦磷酸合酶基因erg20。

3、本发明提供了双功能八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶、番茄红素合酶、类胡萝卜素裂解双加氧酶的异源表达，以及香叶基香叶基二磷酸合酶、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶、异戊烯基焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合酶的过表达在生物合成β-紫罗兰酮中应用。

4、其中，香叶基香叶基二磷酸合酶、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶、异戊烯基焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合酶等4种酶为解脂耶氏酵母po1f的内源性酶，双功能的八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶来源于卷枝毛霉(mucor circinelloides)、编码番茄红素合酶来源于三孢布拉霉(blakeslea trispora)，类胡萝卜素裂解双加氧酶来源于矮牵牛(petunia hybrida)。

5、本发明还提供了如seq id no.2所示的编码双功能八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶的基因mccrtyb、seq id no.3所示的编码番茄红素合酶的基因btcrti、seq id no.4所示的编码类胡萝卜素裂解双加氧酶的基因phccd1的异源表达，以及如seq id no.1所示的编码香叶基香叶基二磷酸合酶的基因ggpps、seq idno.5所示的编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶的基因thmg1、seq id no.6所示的异戊烯基焦磷酸异构酶的基因idi和seqid no.7所示的编码法尼基焦磷酸合酶的基因erg20过表达在解脂耶氏酵母以乙酰辅酶a作为反应底物生物合成β-紫罗兰酮的应用。

6、其中所述seq id no.1所示的编码香叶基香叶基二磷酸合酶的基因、编码seq idno.2所示的编码双功能八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶的基因、seq id no.3所示的编码番茄红素合酶的基因和seq id no.4所示的编码类胡萝卜素裂解双加氧酶的基因；所述seq id no.7所示的编码法尼基焦磷酸合酶的基因、seq id no.5所示的编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶的基因和seq id no.6所示的异戊烯基焦磷酸异构酶的基因为甲羟戊酸途径相关基因。

7、优选地，所述seq id no.2所示的编码双功能八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶的基因在ku70基因位点表达，seq id no.3所示的编码番茄红素合酶的基因在ku80基因位点表达，seq id no.4所示的编码类胡萝卜素裂解双加氧酶的基因在zeta多拷贝位点表达，seq id no.1所示的编码香叶基香叶基二磷酸合酶的基因和seq id no.7所示的编码法尼基焦磷酸合酶的基因在d染色体上的假基因d17位点过表达，seq id no.5所示的编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶的基因、seq id no.6所示的异戊烯基焦磷酸异构酶的基因在pox2位点过表达。

8、优选地，所述菌株用hp4d启动子过表达seq id no.1所示的编码香叶基香叶基二磷酸合酶的基因，异源表达seq id no.2所示的编码双功能八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶的基因、seq id no.3所示的编码番茄红素合酶的基因和seq idno.4所示的编码类胡萝卜素裂解双加氧酶的基因。本发明还提供了重组表达载体在解脂耶氏酵母以乙酰辅酶a作为反应底物生物合成β-紫罗兰酮的中的应用；所述重组表达载体包括编码香叶基香叶基二磷酸合酶的基因、双功能八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶的基因、番茄红素合酶的基因和类胡萝卜素裂解双加氧酶的基因、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶的基因、异戊烯基焦磷酸异构酶的基因、法尼基焦磷酸合酶的基因；编码香叶基香叶基二磷酸合酶的基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；编码双功能八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶的基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；编码番茄红素合酶的基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；编码类胡萝卜素裂解双加氧酶的基因的核苷酸序列如seq id no.4所示；编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶的基因的核苷酸序列如seq id no.5所示；编码异戊烯基焦磷酸异构酶的基因的核苷酸序列如seq id no.6所示；编码法尼基焦磷酸合酶的基因的核苷酸序列如seq id no.7所示的。

9、本发明还提供了一种合成β-紫罗兰酮的方法，在以ypd为培养基，在接种量为1-5％，温度条件为20-35℃、转速100-300rpm条件下发酵培养7-16d下，以菌株为发酵菌株；所述菌株中，双功能八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶、番茄红素合酶、类胡萝卜素裂解双加氧酶表达，以及香叶基香叶基二磷酸合酶、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶、异戊烯基焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合酶过表达或包括如权利要求5中所述的重组表达载体；所述菌株的出发菌株为解脂耶氏酵母po1f；以乙酰辅酶a作为反应底物；编码香叶基香叶基二磷酸合酶的基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；编码双功能八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶的基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；编码番茄红素合酶的基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；编码类胡萝卜素裂解双加氧酶的基因的核苷酸序列seq id no.4所示；编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶的基因的核苷酸序列如seq id no.5所示；编码异戊烯基焦磷酸异构酶的基因的核苷酸序列如seq id no.6所示；编码法尼基焦磷酸合酶的基因的核苷酸序列如seq id no.7所示的。

10、本发明具有以下有益效果：

11、1、本发明以解脂耶氏酵母po1f为出发菌株，通过构建β-紫罗兰酮生物合成途径，并强化了解脂耶氏酵母内源甲羟戊酸途径，解决了β-紫罗兰酮生物合成途径中类胡萝卜素裂解双加氧酶表达量低以及其前体异戊烯基焦磷酸匮乏这两大限制性因素。

12、2、本发明以解脂耶氏酵母po1f为出发菌株，异源表达编码双功能八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶基因mccrtyb、编码番茄红素合酶基因btcrti，以构建产β-胡萝卜素菌株。在此基础上，异源表达来源于矮牵牛的编码类胡萝卜素裂解双加氧酶基因phccd1基因，构建产β-紫罗兰酮的初始菌株，通过过表达解脂耶氏酵母po1f内源基因香叶基香叶基二磷酸合酶基因ggpps、编码法尼基焦磷酸合酶基因erg20、异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因thmg1，优化β-紫罗兰酮合成通路，强化了解脂耶氏酵母内源甲羟戊酸途径，并再结合发酵条件优化，最终达到β-紫罗兰酮产量达到34.41mg/l，相对于现有生物合成技术，实现了β-紫罗兰酮产量大幅度提升。