一种痕量核酸复制保存的方法与流程

本发明涉及一种痕量核酸进行无差别扩增的技术，特别是涉及一种痕量核酸复制保存的方法，属于核酸检测。

背景技术：

1、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)技术类似于dna的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，通过温度变化控制dna的变性和复性，加入设计引物，dna聚合酶、dntp就可以完成特定基因的体外复制，结合dna测序技术，可实现病原的核酸检测、物种的分子鉴定与遗传演化分析等一系列目的。

2、荧光pcr(fluorescence pcr，fpcr)技术实现了pcr从定性到定量的飞跃。它是以标准的定性pcr为基础，在常规体系中添加能够指示反应进程的荧光物质，利用其信号的强弱或有无与扩增子的数量成正相关的原理，对起始模板dna进行定量分析的核酸扩增技术，已经广泛运用于基因工程、遗传学、生物化学与分子生物学、细胞工程、动物或微生物检测等基础性研究范畴，并早已渗透至医疗卫生、基因工程药物、食品安全管控、转基因作物育种、生态环境监控、植物保护、畜牧兽医、考古学与法医学等诸多应用型研究领域。

3、目前，无论pcr技术还是fpcr技术，均对目标核酸的含量有最低拷贝数要求，低于该拷贝数则不能检测到核酸存在，容易造成假阴性，此外，在样本保存、运输及核酸提取等过程中，不可避免会造成部分核酸片段的降解与损失，这更降低了目标核酸的数量与完整性；这些因素导致以上的病毒感染患者在进行早期诊断时，难以通过核酸检测获得确诊，反而可能造成误诊；在未获得核酸检测确凿结果支持的情况下，医生往往只能依靠流行病学史、临床症状及血液生化指标来进行临床诊断，这种诊断需要昂贵、复杂的仪器设备，且与临床医生的实践经验密切相关，存在较大的主观性，这种情况不仅不利于患者的早期诊断与合理治疗，甚至导致临床高度疑似感染患者或低病毒潜伏的“假痊愈患者”检测“假阴性”现象频发，相关机构也难以判定是否应该采取相应的措施，不利于相关部门进行科学判断与决策。

4、此外，在对虫媒疫病的病原进行鉴定或流行病学调查分析时，难以对其卵、幼虫等形态发育不全的阶段进行形态学鉴定；同时由于其体型轻小，不能满足常规试剂盒提取核酸所需的最低重量，勉强提取的核酸则因浓度太低而无法进行物种的分子生物学鉴定或病原的核酸检测。

5、因此，亟需对痕量核酸复制保存的方法进行改进，以解决上述存在的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种痕量核酸复制保存的方法，可将目标样本中的核酸进行无差别倍增，适用样本范围广泛，包括人与动物的全血、组织培养细胞、显微切割得到的细胞、速冻的组织切片、血浆血清中的细胞、口腔细胞、血斑等样本中的dna等，以及蚊、螨、蠓、蜱等微小媒介动物，进而实现对样本中所含目标核酸的检测，能够提高目标核酸的数量与完整性，降低误诊的概率，从而大大降低了核酸检测的准确性。

2、为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

3、一种痕量核酸复制保存的方法，包括以下步骤：

4、步骤一：材料准备阶段，包括随机六碱基引物、phi29 dna聚合酶、超纯水和目标dna以及dntp和bsa；

5、步骤二：样本处理阶段，将所述步骤一中的材料等比例混合分批加入进行多重置换扩增，并加入不同质量的所述超纯水进行稀释，打造出多种反应体系，其过程在高温环境下进行；

6、步骤三：恒温孵育阶段，所述反应体系在金属浴中进行两次或多次孵育，孵育过程中温度依次升高，合适温度时反应终止，对扩增产物进行收集储存。

7、优选的，所述步骤一具体为：

8、s1：以剪碎溶解等常规手段提取所述目标dna(对于rna需事先反转录为cdna)，采用磷酸二酯化合物合成技术合成所述随机六碱基引物，phi29 dna聚合酶、超纯水以及dntp和bsa若干。

9、优选的，所述步骤二具体为：

10、s2：按比例加入所述随机六碱基引物、所述phi29 dna聚合酶、所述超纯水和所述目标dna，混匀；

11、s3：将所述混合液置于95℃所述金属浴中加热3min后冰浴15min；

12、s4：按比例继续加入所述dntp、所述bsa和所述phi29 dna聚合酶，混匀；

13、优选的，所述步骤三具体为：

14、s5：将所述反应体系置于30℃所述金属浴中孵育8-12h；

15、s6：所述金属浴升温至65℃，继续孵育所述反应体系10min终止反应。

16、优选的，所述步骤二中所述随机六碱基引物、所述phi29 dna聚合酶、所述超纯水和所述目标dna的混合比例约为5：2：9：2。

17、优选的，所述步骤二中所述dntp、所述bsa和所述phi29 dna聚合酶的加入比例约为5：2：5。

18、优选的，所述步骤二和步骤三均在无菌ep管内进行。

19、优选的，所述金属浴型号为md35干式恒温金属浴。

20、优选的，所述多重置换扩增产物低温保存或直接进行普通pcr、qpcr实验。

21、本发明至少具备以下有益效果：

22、1、本发明可将目标样本中的核酸进行无差别倍增，适用样本范围广泛，包括人与动物的全血、组织培养细胞、显微切割得到的细胞、速冻的组织切片、血浆血清中的细胞、口腔细胞、血斑等样本中的dna等，以及蚊、螨、蠓、蜱等微小媒介动物，进而实现对样本中所含目标核酸的检测，能够提高目标核酸的数量与完整性，降低误诊的概率，从而大大降低了核酸检测的准确性。

23、2、本发明扩增产物产量高，10ng基因组dna经扩增，可产生15ug及以上(20ul反应体系)的dna反应产物，扩增倍数可达数万倍。

24、3、本发明扩增产物具有良好的稳定性，易于保存，在-80℃冷冻条件下保存期可达2年以上，-20℃冷冻条件下保存期可达6个月以上，4℃冷藏条件下保存期可达4周以上，非常适合于建立核酸资源库。

25、4、本发明扩增产物应用途径广阔，适用于pcr(包括普通多重pcr、套式pcr以及qpcr)、克隆、文库构建、单倍型确定、测序、基因芯片、遗传分析(片段差异、微卫星差异、单碱基差异、snp、str)等。

26、5、本发明扩增产物中目标dna浓度较高，在稀释适当倍数(例如稀释10倍)后使用仍可达到满意的效果，从而减少了核酸资源的消耗。

技术特征：

1.一种痕量核酸复制保存的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种痕量核酸复制保存的方法，其特征在于：所述步骤一具体为：

3.根据权利要求1所述的一种痕量核酸复制保存的方法，其特征在于：所述步骤二具体为：

4.根据权利要求1所述的一种痕量核酸复制保存的方法，其特征在于：所述步骤三具体为：

5.根据权利要求3所述的一种痕量核酸复制保存的方法，其特征在于：所述步骤二中所述随机六碱基引物、所述phi29 dna聚合酶、所述超纯水和所述目标dna的混合比例约为5：2：9：2。

6.根据权利要求3所述的一种痕量核酸复制保存的方法，其特征在于：所述步骤二中所述dntp、所述bsa和所述phi29 dna聚合酶的加入比例约为5：2：5。

7.根据权利要求1所述的一种痕量核酸复制保存的方法，其特征在于：所述步骤二和步骤三均在无菌ep管内进行。

8.根据权利要求1所述的一种痕量核酸复制保存的方法，其特征在于：所述金属浴型号为md35干式恒温金属浴。

9.根据权利要求1所述的一种痕量核酸复制保存的方法，其特征在于：所述多重置换扩增产物低温保存或直接进行普通pcr、qpcr实验。

技术总结本发明涉及核酸检测领域，具体为一种痕量核酸复制保存的方法，包括步骤一：材料准备阶段、步骤二：样本处理阶段和步骤三：恒温孵育阶段。本发明可将目标样本中的核酸进行无差别倍增，适用样本范围广泛，包括人与动物的全血、组织培养细胞、显微切割得到的细胞、速冻的组织切片、血浆血清中的细胞、口腔细胞、血斑等样本中的DNA等，以及蚊、螨、蠓、蜱等微小媒介动物，进而实现对样本中所含目标核酸的检测，能够提高目标核酸的数量与完整性，降低误诊的概率，从而大大降低了核酸检测的准确性。技术研发人员：韩小虎,姜峰,陈泽良,张力华,肖成勇受保护的技术使用者：深圳蓝韵生物医疗科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/8/27