一种青岛百合高效离体再生方法

本发明涉及植物组织培养和快速繁殖，具体涉及一种青岛百合高效离体再生方法。

背景技术：

1、青岛百合(lilium tsingtauense gilg)又名崂山百合，为百合科百合属多年生单子叶草本植物。青岛百合株形独特，叶片轮生，颜色碧绿，花大而鲜艳，花瓣橙黄色或橙红色，上面有许多红色斑点，极具观赏价值；同时，其鳞茎富含淀粉、百合多糖、氨基酸和甾体皂苷，既可食用也可药用，其药效成分甾体皂苷和百合多糖具有清心安神、润肺止咳的功效。侯贵传等对青岛百合的生药特性进行了研究，结果发现，青岛百合药材比目前使用的百合商品药材鳞片小，颜色稍深；从鳞茎中检测出17种氨基酸，其中7种氨基酸是人体必需的(侯贵传，徐立，陈惠云等.青岛百合生药学特性的研究.莱阳农学院学报，1991，(02):143-146)。因此，青岛百合是一种开发利用价值很高的经济植物。目前，青岛百合集中分布在青岛崂山巨峰风景区和即墨瓦娄山一带，以及烟台海阳市招虎山国家森林公园中。因其分布范围狭窄，对生长条件要求苛刻，现已逐渐稀少，2021年被列入国家珍稀濒危植物名录。在自然条件下，青岛百合的结实率不高，种子萌发力差，种群的数量很难增长。近年来随着旅游资源的开发，崂山的植被逐渐遭到较大程度的破坏，使青岛百合的生境逐渐丧失，加之游客的肆意采摘和当地群众的过度采挖，从而使原来生长在这里的青岛百合数量迅速下降，面临绝迹的危险，亟待保护。人工快速繁殖是目前保护珍稀濒危植物行之有效的措施之一，赵宇等以野生的青岛百合鳞茎为扦插材料,在温度为25℃，珍珠岩基质中，内层鳞片扦插效果最好(赵宇，刘庆华，王奎玲等.青岛百合扦插繁殖技术的研究.山东林业科技，2007，(03):16-18)。近年来，用先进的组织培养方法来繁殖百合已经成为一种行之有效的方法。目前，国内外对青岛百合人工繁殖的研究较少。据报道，青岛百合栽培中存在着分球繁殖，数量有限；鳞片扦插易腐烂，成活率低，且易造成退化等问题(赵宇，刘庆华，王奎玲等.青岛百合扦插繁殖技术的研究,山东林业科技，2007，(03):16-18)；赵秀芳、赵强等、韩怡等(2011)、郭雪莲等、于健华对青岛百合的组培快繁技术进行了探究(赵秀芳.青岛百合组培快繁技术研究.安徽农业科学，2005，(02):254-341；赵强，李庆典，赵玉岭.青岛百合的组织培养技术研究.北方园艺，2007，(06):213-214；韩怡，任强，郭道森等.一种崂山百合的离体快速繁殖技术.现代生物医学进展，2011，11(18):3453-3457；郭雪莲，刘庆超，王奎玲等.微环境对‘青岛百合’生根的影响.甘肃农业大学学报，2013，48(02):40-45；于健华.青岛百合的资源调查、成分分析和组培快繁研究[硕士论文].青岛大学，2013)，他们使用的培养基激素配比都不一样，而且对繁殖系数没有统计分析。

2、因此需要开发一种青岛百合高效离体再生方法。

技术实现思路

1、本发明选用青岛百合的鳞片作为外植体进行组织培养，研究了不同植物生长调节剂配比对外植体不定芽诱导、继代增殖、分化生根的影响，从而获得一种青岛百合高效快速繁殖技术，为扩大青岛百合种群分布范围，保护其种质资源，合理开发和利用青岛百合提供一定的参考。

2、本发明以青岛百合的鳞片为外植体进行了离体再生研究，主要包括外植体消毒、不定芽诱导、继代增殖、分化生根。

3、本发明提供的一种青岛百合高效离体再生方法，包括如下步骤：

4、(1)剥取青岛百合鳞茎的中外层鳞片，消毒除杂菌；

5、(2)将鳞片纵切成两半，将纵切面凸面贴向诱导培养基上，诱导培养出不定芽；

6、(3)将诱导出的不定芽接种到增殖培养基上进行增殖培养，获得丛生芽；

7、(4)将丛生芽接种到生根培养基上进行生根培养，获得根系健壮的无菌组培苗；

8、所述不定芽诱导培养基为：ms培养基中添加0.5-1.0mg/l naa+0.8-1.5mg/l 6-ba+25-35g/l蔗糖+琼脂6.0-8.0g/l，ph＝5.5～6.2；

9、增殖培养基为ms培养基中添加0.05-0.15mg/l naa+1.0-2.0mg/l 6-ba+25-35g/l蔗糖+琼脂6.0-8.0g/l，ph＝5.5～6.2。

10、优选地，所述不定芽诱导培养基为：ms+0.7mg/l naa+1.2mg/l 6-ba+30g/l蔗糖+琼脂7.0g/l，ph＝5.7～6.0；增殖培养基为ms+0.1mg/l naa+1.5mg/l 6-ba+30g/l蔗糖+琼脂7.0g/l，ph＝5.7～6.0。

11、在具体实施方式中，生根培养基为：ms+0.2-0.8mg/l naa+50-70g/l蔗糖+琼脂6.5-7.5g/l，ph＝5.5～6.2。优选地，生根培养基为：ms+0.5mg/l naa+60g/l蔗糖+琼脂7.0g/l，ph＝5.7～6.0。

12、具体地，诱导发芽和继代增殖培养条件为光照50-70μmol·m-2·s-114-16h/d，培养温度为25±2℃。

13、任选地，进一步地，还包括下述步骤：

14、(5)组培苗移栽定植到栽培基质里，获得青岛百合的种苗。

15、具体地，移栽定植基质为：泥炭、菜园土和珍珠岩。更具体地，泥炭、菜园土和珍珠岩的比例为1∶1∶1。优选地，生根培养条件为25±2℃，保持黑暗培养。

16、在一个极具体的实施方式中，所述青岛百合高效离体再生方法包括如下步骤：

17、(1)外植体消毒处理：选取健壮饱满的青岛百合鳞茎，用自来水冲洗干净表面附着的泥土，剥开鳞茎，将表面较完整、伤痕较少的中外层鳞片放入已添加洗洁精的瓶中，用自来水冲洗45min。在超净工作台中进行鳞片消毒，先用75％的酒精表面消毒1min，灭菌蒸馏水冲洗3次，每次2min，再用84消毒液(有效氯5％)灭菌15min，最后用灭菌蒸馏水冲洗4-5次，每次2min。

18、(2)不定芽诱导：将步骤(1)中所得的外植体接种到不定芽诱导培养基(ms+0.7mg/lnaa+1.2mg/l 6-ba+30g/l蔗糖+琼脂7.0g/l，ph＝5.8)上，鳞茎凸面贴向培养基。培养条件为(50-70μmol·m-2·s-1)14-16h/d，培养温度25±2℃。

19、(3)继代增殖：将步骤(2)诱导出的生长旺盛的不定芽切下转移到继代增殖培养基(ms+0.1mg/l naa+1.5mg/l 6-ba+30g/l蔗糖+琼脂7.0g/l，ph＝5.8)上进行扩繁，培养条件为(50-70μmol·m-2·s-1)14-16h/d，培养温度25±2℃。

20、(4)不定根诱导：将步骤(3)获得的生长健壮、大小相近的百合鳞茎单株转到生根培养基(ms+0.5mg/l naa+60g/l蔗糖+琼脂7.0g/l，ph＝5.8)中，培养条件为黑暗培养，培养温度为25±2℃。

21、(5)将步骤(4)获得的生根组培苗连同培养基、培养瓶等一起转入25±2℃、光照(60μmol·m-2·s-1)16h/d的培养条件下进行耐受培养1-2周后，打开培养瓶盖子，注入10-20ml无菌水或去离子水，炼苗5-8天。

22、(6)移栽定植：将生根小苗移栽到泥炭、菜园土和珍珠岩(1∶1∶1)的基质中，在25±2℃、自然光照的大棚中生长良好，成为与自然生长小苗一致的青岛百合再生植株。

23、本发明通过研究探索，包括处理步骤和激素配方等的实验研究，最终成功以青岛百合的鳞片为外植体实现了高效离体再生，因而本发明的方法具有较大的实用价值。