一种纤维寡糖磷酸化酶StCDP及酶解制备葡萄糖-1-磷酸的方法

本发明属于工程酶，具体涉及一种纤维寡糖磷酸化酶stcdp及酶解制备葡萄糖-1-磷酸的方法。

背景技术：

1、在生物体内，葡萄糖-1-磷酸是一个重要的中间体，由葡聚糖磷酸化酶催化糖原或淀粉磷酸化产生，然后被磷酸葡萄糖异构酶转化为葡萄糖-6-磷酸，进入葡萄糖分解途径。葡萄糖-1-磷酸作为一种活化葡萄糖，作为生物体内合成糖脂、寡糖、糖核苷酸等复合糖化合物的重要前体。随着生物合成技术的发展，葡萄糖-1-磷酸可以应用于合成人工淀粉、昆布聚糖、槐多糖等生物制造过程。因此，开发高效的葡萄糖-1-磷酸生产方法具有广泛的应用价值。

2、纤维素为自然界中最丰富的天然可再生资源，通过纤维素酶水解可生产大量的纤维二糖和纤维寡糖，这些产物在多糖磷酸化酶的作用下可以生产葡萄糖-1-磷酸。相比较于以淀粉和蔗糖为底物生产葡萄糖-1-磷酸途径，以纤维二糖和纤维寡糖为底物的生产途径，不会与食物发生竞争。以纤维二糖为底物，采用纤维二糖磷酸化酶，其产率仅为50％。而以纤维寡糖为底物的纤维寡糖磷酸化，生产葡萄糖-1-磷酸的产率可以有效提高。如以纤维三糖、纤维四糖和纤维五糖为底物生产葡萄糖-1-磷酸，其产率可以分别达到67％、75％和80％。因此，可以通过偶联高产纤维寡糖的纤维素酶—纤维寡糖磷酸化酶，高效生产葡萄糖-1-磷酸，有效降低其生产成本。如sawano等于2013年，以5.2g/l纤维三糖为底物，采用源自白色瘤胃球菌(ruminococcus albus)的racdp(febs journal 2013,280(18),4463-4473)，转化效率为46％；liu等于2019年，以0.26g/l纤维三糖为底物，采用源自(ruminiclostridium cellulolyticum)的纤维寡糖磷酸化酶cdpc生产葡萄糖-1-磷酸，转化效率为55.7％(biotechnology for biofuels 2019,12(1),208)，但存在转化效率低的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种纤维寡糖磷酸化酶stcdp及酶解制备葡萄糖-1-磷酸的方法，利用纤维寡糖为原料，通过简单的纤维寡糖磷酸化酶stcdp处理，可以实现葡萄糖-1-磷酸的高效生产，具有原料利用率高、葡萄糖-1-磷酸产率高，生产成本低等优点。

2、本发明提供了一种纤维寡糖磷酸化酶stcdp，所述纤维寡糖磷酸化酶stcdp的氨基酸序列如seq id no.1所示。

3、本发明还提供了上述纤维寡糖磷酸化酶的编码基因stcdp，所述编码基因stcdp的核苷酸序列如seq id no.2所示。

4、本发明还提供了包含上述编码基因stcdp并表达上述纤维寡糖磷酸化酶stcdp的重组表达载体。

5、本发明还提供了一种包含上述重组表达载体的重组表达细胞。

6、优选的，所述重组表达细胞以原核细胞为宿主细胞。

7、本发明还提供了上述纤维寡糖磷酸化酶stcdp的制备方法，包括将上述重组表达细胞培养成种子液，将所述种子液接种到含对应抗生素的液体培养基中进行诱导表达，收集菌体；

8、对菌体破碎后，收集上清液，上清液中含所述纤维寡糖磷酸化酶stcdp。

9、本发明还提供了上述纤维寡糖磷酸化酶stcdp在酶解制备葡萄糖-1-磷酸中的应用。

10、本发明还提供了一种酶解制备葡萄糖-1-磷酸的方法，包括以下步骤：以纤维寡糖为原料，利用上述纤维寡糖磷酸化酶stcdp进行酶解，酶解产物中包括所述葡萄糖-1-磷酸。

11、优选的，所述纤维寡糖包括以下至少一种：纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖和纤维六糖。

12、优选的，所述酶解的温度为25～75℃，所述酶解的时间为10min～48h。

13、有益效果：本发明提供了一种纤维寡糖磷酸化酶stcdp，所述纤维寡糖磷酸化酶stcdp的氨基酸序列如seq id no.1所示。本发明所述纤维寡糖磷酸化酶stcdp来自嗜热螺旋体(spirochaeta thermophila)的纤维寡糖磷酸化酶基因(wp_014625716.1)进行密码子优化，并合成获得该蛋白基因后经原核表达后获得。本发明所述纤维寡糖磷酸化酶stcdp具有优异的耐热性，在25～75℃温度范围内都具有高催化活力，属于嗜热纤维寡糖磷酸化酶，该酶具有更宽泛的最适反应温度，在75℃下，该酶无催化活力丧失，具有更优的热稳定性。

14、本发明利用纤维素降解产物，纤维寡糖为原料，通过简单的纤维寡糖磷酸化酶stcdp处理，可以实现葡萄糖-1-磷酸的高效生产，具有原料利用率高、葡萄糖-1-磷酸产率高，生产成本低等优点。本发明实施例中，在25～75℃条件下，1000u所述纤维寡糖磷酸化酶stcdp经10小时可以转化纤维寡糖制备17.6～19.7g/l葡萄糖-1-磷酸。

技术特征：

1.一种纤维寡糖磷酸化酶stcdp，其特征在于，所述纤维寡糖磷酸化酶stcdp的氨基酸序列如seq id no.1所示。

2.权利要求1所述纤维寡糖磷酸化酶的编码基因stcdp，其特征在于，所述编码基因stcdp的核苷酸序列如seq id no.2所示。

3.包含权利要求2所述编码基因stcdp并表达权利要求1所述纤维寡糖磷酸化酶stcdp的重组表达载体。

4.一种包含权利要求3所述重组表达载体的重组表达细胞。

5.根据权利要求4所述重组表达细胞，其特征在于，所述重组表达细胞以原核细胞为宿主细胞。

6.权利要求1所述纤维寡糖磷酸化酶stcdp的制备方法，其特征在于，包括将权利要求4或5所述重组表达细胞培养成种子液，将所述种子液接种到含对应抗生素的液体培养基中进行诱导表达，收集菌体；

7.权利要求1所述纤维寡糖磷酸化酶stcdp在酶解制备葡萄糖-1-磷酸中的应用。

8.一种酶解制备葡萄糖-1-磷酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：以纤维寡糖为原料，利用权利要求1所述纤维寡糖磷酸化酶stcdp进行酶解，酶解产物中包括所述葡萄糖-1-磷酸。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述纤维寡糖包括以下至少一种：纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖和纤维六糖。

10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述酶解的温度为25～75℃，所述酶解的时间为10min～48h。

技术总结本发明提供了一种纤维寡糖磷酸化酶StCDP及酶解制备葡萄糖‑1‑磷酸的方法，属于工程酶技术领域。本发明提供了一种纤维寡糖磷酸化酶StCDP，所述纤维寡糖磷酸化酶StCDP的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明所述纤维寡糖磷酸化酶StCDP具有优异的耐热性，在25～75℃温度范围内都具有高催化活力，属于嗜热纤维寡糖磷酸化酶，该酶具有更宽泛的最适反应温度。本发明利用纤维素降解产物，纤维寡糖为原料，通过简单的纤维寡糖磷酸化酶StCDP处理，可以实现葡萄糖‑1‑磷酸的高效生产，具有原料利用率高、葡萄糖‑1‑磷酸产率高(17.6～19.7g/L)，生产成本低等优点。技术研发人员：林晖,陈红歌,龚会平,刘新育,王明道,裴亚欣受保护的技术使用者：河南农业大学技术研发日：技术公布日：2024/9/2