一种衍生方式测定阿哌沙班中5-氯戊酸基因毒性杂质的方法与流程

本发明涉及药物分析检测，具体涉及一种衍生方式测定阿哌沙班中5-氯戊酸基因毒性杂质的方法。

背景技术：

1、阿哌沙班（apixaban），化学名为1-(4-甲氧基苯基)-7-氧代-6-[4-(2-氧代哌啶-1-基)苯基]-4,5,6,7-四氢-1h-吡唑[3,4-c]-吡啶-3-甲酰胺，阿哌沙班是一种口服型、可逆性、fxa选择活性部位抑制剂。其发挥抗凝血活性作用时不需要抗凝血酶iii的参与。阿哌沙班抑制游离性以及与凝血块结合的fxa，具有凝血酶原酶活性。阿哌沙班不直接影响血小板凝集，但是直接抑制由凝血酶引起的血小板凝集。通过抑制fxa，阿哌沙班减少凝血酶增殖以及血栓生成。

2、目前阿哌沙班的较常见合成工艺见下式：

3、

4、上述制备工艺中会用到5-氯戊酰氯（ⅱb），5-氯戊酰氯遇水后完全水解为5-氯戊酸，5-氯戊酸又会与乙醇反应生成5-氯戊酸乙酯，阿哌沙班合成工艺中需要对样品进行水洗操作，所存在的起始原料ⅱb（5-氯戊酰氯），且工艺中会用到乙醇，最终将以5-氯戊酸乙酯的形式存在，由于5-氯戊酸乙酯存在“卤代烷烃”的基因警示结构，属于基因毒性杂质，按基因毒性杂质的限度在阿哌沙班中进行质控。

5、根据其对应制剂（阿哌沙班片，2.5mg）的用量说明，本品的最大日剂量为5mg/天，基因毒性杂质按限度为ttc=1.5μg/天计算，其相应限度为“限度=1.5μg/5mg=300×10-6=300ppm”。

6、阿哌沙班工艺中一共有8个相同警示结构的杂质（具体信息见下表），每个杂质的限度为=300ppm/8=37.5ppm，按37.5ppm进行控制。阿哌沙班中含有“卤代烷烃”结构的杂质汇总：

7、

8、鉴于基因毒性杂质的极高的检测需求，且5-氯戊酸乙酯的响应又较小的情形下，如何开发合理且符合检测需求的方法对其进行有效质控，对提高药品有效性和安全性有显著帮助。

技术实现思路

1、本发明克服了现有技术存在的不足，提供了一种响应更为灵敏、检测时间更短的衍生方式测定阿哌沙班中5-氯戊酸基因毒性杂质方法。

2、为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种衍生方式测定阿哌沙班中5-氯戊酸基因毒性杂质的方法，包含以下步骤：

3、步骤一，对5-氯戊酸乙酯类杂质进行衍生处理，配置成标准溶液；

4、步骤二，采用高效液相与质谱联用仪对所述标准溶液进行检测并制得标准曲线；

5、步骤三，取阿哌沙班成品精确称量，用衍生法对其进行衍生处理，制成样品溶液；

6、步骤四，采用高效液相与质谱联用仪对所述样品溶液进行检测，其检测结果根据步骤二中绘制的标准曲线计算得到样品溶液中5-氯戊酸乙酯类杂质的含量。

7、所述衍生方法为：取待测样品，置单口瓶1中，加氯化亚砜，加热并搅拌回流；停止加热，加入甲苯，60℃减压浓缩至干，得油状物，加入二氯甲烷，搅拌溶清后，得溶液a；另取单口瓶2，加入苯胺、三乙胺和二氯甲烷，搅拌冷却至0℃，逐滴加入溶液a，滴毕室温搅拌反应3h，分别加水、饱和氯化钠溶液洗涤分层，二氯甲烷层于40℃减压浓缩至干，即得进样样品。

8、所述的0.5％甲酸水溶液为流动相a；甲酸的比例为0.4%~0.6%。

9、所述高效液相与质谱联用仪测定参数为：以0.5％甲酸水溶液为流动相a，流动相a中甲酸的比例可以为0.4%~0.6%之间，以乙腈为流动相b，流速为每分钟0.6分钟，设置质谱参数：mrm模式，esi源，positive，离子对（m/z）=212/94，进样量为1μl，以体积比计，洗脱程序为：以流动相a为50%，流动相b为50%等度洗脱0.5分钟，0.5分钟后逐步减少流动相a比例，逐渐增加流动相b比例，至1.5分钟流动相a达到5%，流动相b达到95%，至3.5分钟时流动相a达到0%，流动相b达到100%，3.51分钟时回调流动相a与流动相b比例至初始比例，维持至6.0分钟。

10、所述的质谱参数为mrm模式，esi源，positive，离子对（m/z）=212/94。

11、5-氯戊酸衍生物在7.12～71.24ppm范围内线性关系良好，相关系数r不低于0.999。

12、本发明与现有技术相比具有的有益效果是：解决了无法采用有效手段检测5-氯戊酸等基因毒性杂质的检测难题，所提供方法，经验证各项指标均符合方法需求，在专属性、定量限、检测限、线性范围以及重复性上表现出显著的优势，具有检测方法更环保、适用性更广、精密度和准确度高、重复性好以及系统适用性好等优点，为阿哌沙班药品的质量控制提供重要的方法检测参考依据。

技术特征：

1.一种衍生方式测定阿哌沙班中5-氯戊酸基因毒性杂质的方法，其特征在于，包含以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种衍生方式测定阿哌沙班中5-氯戊酸基因毒性杂质的方法，其特征在于，所述衍生方法为：取待测样品，置单口瓶1中，加氯化亚砜，加热并搅拌回流；停止加热，加入甲苯，60℃减压浓缩至干，得油状物，加入二氯甲烷，搅拌溶清后，得溶液a；另取单口瓶2，加入苯胺、三乙胺和二氯甲烷，搅拌冷却至0℃，逐滴加入溶液a，滴毕室温搅拌反应3h，分别加水、饱和氯化钠溶液洗涤分层，二氯甲烷层于40℃减压浓缩至干，即得进样样品。

3.根据权利要求1所述的一种衍生方式测定阿哌沙班中5-氯戊酸基因毒性杂质的方法，其特征在于，所述的0.5％甲酸水溶液为流动相a；甲酸的比例为0.4%~0.6%。

4.根据权利要求1所述的一种衍生方式测定阿哌沙班中5-氯戊酸基因毒性杂质的方法，其特征在于，所述高效液相与质谱联用仪测定参数为：以0.5％甲酸水溶液为流动相a，流动相a中甲酸的比例可以为0.4%~0.6%之间，以乙腈为流动相b，流速为每分钟0.6分钟，设置质谱参数：mrm模式，esi源，positive，离子对（m/z）=212/94，进样量为1μl，以体积比计，洗脱程序为：以流动相a为50%，流动相b为50%等度洗脱0.5分钟，0.5分钟后逐步减少流动相a比例，逐渐增加流动相b比例，至1.5分钟流动相a达到5%，流动相b达到95%，至3.5分钟时流动相a达到0%，流动相b达到100%，3.51分钟时回调流动相a与流动相b比例至初始比例，维持至6.0分钟。

5.根据权利要求1所述的一种衍生方式测定阿哌沙班中5-氯戊酸基因毒性杂质的方法，其特征在于，所述的质谱参数为mrm模式，esi源，positive，离子对（m/z）=212/94。

6.根据权利要求1所述的一种衍生方式测定阿哌沙班中5-氯戊酸基因毒性杂质的方法，其特征在于，5-氯戊酸衍生物在7.12～71.24ppm范围内线性关系良好，相关系数r不低于0.999。

技术总结本发明涉及药物分析检测技术领域，具体涉及一种衍生方式测定阿哌沙班中5‑氯戊酸基因毒性杂质的方法；采用的技术方案为：步骤一，对5‑氯戊酸乙酯类杂质进行衍生处理，配置成标准溶液；步骤二，采用高效液相与质谱联用仪对所述标准溶液进行检测并制得标准曲线；步骤三，取阿哌沙班成品精确称量，用衍生法对其进行衍生处理，制成样品溶液；步骤四，采用高效液相与质谱联用仪对所述样品溶液进行检测，其检测结果根据步骤二中绘制的标准曲线计算得到样品溶液中5‑氯戊酸乙酯类杂质的含量；本发明广泛应用于基因毒性杂质检测领域。技术研发人员：花淑文,梁小丽,张晓阳,梁通达,李银芳,李忠宝受保护的技术使用者：云鹏医药集团有限公司技术研发日：技术公布日：2024/9/2