PHL7酶突变体及其应用的制作方法

本发明属于酶工程，涉及一种pet降酶，具体涉及一种phl7酶突变体及其应用。

背景技术：

1、聚对苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，pet）是塑料的一种，因其具有高机械强度、低透气性、重量轻、成本价格低等优点，目前pet在农业、工业、医学领域都有广泛的应用。随着其应用领域的扩大，其使用量急剧上升，但未经过人工处理的pet在自然情况下很难被降解，因此对环境损害严重。

2、生物酶降解法利用日益发展的生物酶技术降解塑料，因其具有绿色、环保等特点，有望被应用于工厂塑料废弃物的降解中。pet酶解由于环境友好受到了重点关注。2021年，采用宏基因组方法分离出的phl7酶（ena号：lt571446），在当时成为降解效果最好的酶。其在16小时可以降解90%的无定形pet，18小时完全降解pet，成为非常有价值和潜力的pet水解酶。但是，若将phl7酶的热稳定性或者phl7酶降解活性进一步提高，对于扩大该酶的适用范围、更高效降解pet具有重要意义。

技术实现思路

1、鉴于现有技术中存在的上述问题，本发明通过对phl7酶进行改造，提供一种降解活性显著提高的phl7酶突变体及其应用。

2、为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种phl7酶突变体，其氨基酸序列如seq id no.2所示。

4、本发明提供了一种phl7酶突变体，所述phl7酶突变体为突变体h185y，是以野生型phl7酶氨基酸序列中第185位的组氨酸定点突变为酪氨酸所得。突变体h185y较野生型phl7酶而言，其pet降解活性提升了71%，tm提升0.13℃。

5、其中，野生型phl7酶的氨基酸序列如seq id no.1所示；突变体h185y的氨基酸序列如seq id no.2所示。

6、第二方面，在上述突变体h185y的基础上，本发明对突变体h185y的氨基酸序列分别在第145位、第148位、第158位、第184位、第213位、第214位和第218位进行单点突变，提供了八种phl7酶突变体，其氨基酸序列为如下（1）~（8）中的任一项：

7、（1）将seq id no.2所示氨基酸序列的第145位的苏氨酸定点突变为脯氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，记为突变体m1-t145p；

8、（2）将seq id no.2所示氨基酸序列的第148位的谷氨酸定点突变为赖氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，记为突变体m1-e148k；

9、（3）将seq id no.2所示氨基酸序列的第148位的谷氨酸定点突变为谷氨酰胺，其他位置的氨基酸残基不变，记为突变体m1-e148q；

10、（4）将seq id no.2所示氨基酸序列的第158位的苏氨酸定点突变为脯氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，记为突变体m1-t158p；

11、（5）将seq id no.2所示氨基酸序列的第184位的丝氨酸定点突变为谷氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，记为突变体m1-s184e；

12、（6）将seq id no.2所示氨基酸序列的第213位的天冬酰胺定点突变为亮氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，记为突变体m1-n213l；

13、（7）将seq id no.2所示氨基酸序列的第214位的苏氨酸定点突变为丝氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，记为突变体m1-t214s；

14、（8）将seq id no.2所示氨基酸序列的第218位的苏氨酸定点突变为脯氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，记为突变体m1-t218p；

15、其中，上述m1表示h185y。

16、经测试发现，相较于野生型phl7酶，上述八种突变体中突变体m1-s184epet降解活性增长幅度最大，提升了107.8%，此外，突变体m1-s184e的tm提升了2.33℃。

17、第三方面，在上述突变体m1-s184e的基础上，本发明对突变体m1-s184e的氨基酸序列进一步单点突变，即基于突变体h185y的氨基酸序列进行两点组合突变，提供五种phl7酶突变体，其氨基酸序列为如下（9）~（13）中的任一项：

18、（9）将seq id no.2所示氨基酸序列的第145位的苏氨酸定点突变为脯氨酸，同时第184位的丝氨酸定点突变为谷氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，记为突变体m2-t145p；

19、（10）将seq id no.2所示氨基酸序列的第148位的谷氨酸定点突变为赖氨酸，同时第184位的丝氨酸定点突变为谷氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，记为突变体m2-e148k；

20、（11）将seq id no.2所示氨基酸序列的第148位的谷氨酸定点突变为谷氨酰胺，同时第184位的丝氨酸定点突变为谷氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，记为突变体m2-e148q；

21、（12）将seq id no.2所示氨基酸序列的第158位的苏氨酸定点突变为脯氨酸，同时第184位的丝氨酸定点突变为谷氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，记为突变体m2-t158p；

22、（13）将seq id no.2所示氨基酸序列的第184位的丝氨酸定点突变为谷氨酸，同时第218位的苏氨酸定点突变为脯氨酸，其他位置的氨基酸残基不变记为突变体m2-t218p；

23、其中，所述m2代表m1-s184e，即h185y/s184e。

24、经测试发现，相较于野生型phl7酶，上述五种突变体pet降解活性显著提升。其中突变体m2-e148k的活性以及热稳定性显著提高，其中，其活性提升了110%左右，其tm提升了3.97℃。

25、第四方面，基于突变体h185y的氨基酸序列进行三点组合突变，提供三种phl7酶突变体，其氨基酸序列为如下（14）~（16）中的任一项：

26、（14）将seq id no.2所示氨基酸序列的第145位的苏氨酸定点突变为脯氨酸，同时第148位的谷氨酸定点突变为赖氨酸，第184位的丝氨酸定点突变为谷氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，记为突变体m2-t145p/e148k；

27、（15）将seq id no.2所示氨基酸序列的第148位的谷氨酸定点突变为赖氨酸，同时第158位的苏氨酸定点突变为脯氨酸，第184位的丝氨酸定点突变为谷氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，记为突变体m2-e148k/t158p；

28、（16）将seq id no.2所示氨基酸序列的第145位的苏氨酸定点突变为脯氨酸，同时第158位的苏氨酸定点突变为脯氨酸，第184位的丝氨酸定点突变为谷氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，记为突变体m2-t145p/t158p；

29、其中，所述m2代表m1-s184e，即h185y/s184e。

30、经测试发现，相比于野生型phl7酶，上述三种突变体的pet降解活性提升了114.7%~138.8%。

31、第五方面，本发明提供了一种重组质粒，所述重组质粒可表达第一方面至第四方面中任一方面所述的phl7酶突变体。

32、第六方面，本发明提供了一种phl7酶突变体工程菌株，其包含第五方面所述的重组质粒。

33、优选地，所述工程菌株的宿主细胞为大肠杆菌。

34、第七方面，本发明提供了上述第一方面至第四方面中任一方面所述的phl7酶突变体在降解pet、制备pet降解剂或制备降解pet产品中的应用。

35、第八方面，本发明提供了上述重组质粒在降解pet、制备pet降解剂或制备降解pet产品中的应用。

36、第九方面，本发明提供了上述phl7酶突变体工程菌株在降解pet、制备pet降解剂或制备降解pet产品中的应用。

37、本发明通过理性分子进化，将phl7酶进行突变，得到了一种pet降解活性和/或热稳定性显著提高的phl7酶突变体。野生型phl7酶相比，本发明保护的16种phl7酶突变体的pet降解活性提高了71.0%~138.8%。其中，突变体m2-e148k/t158p与野生型phl7酶相比，其pet降解活性提高了138.8%，其tm提高了1.48℃。本发明提供的phl7酶突变体可应用于降解pet、制备pet降解剂或制备降解pet产品等领域。