一种化合物对胰岛素分泌刺激效应的检测方法

本发明属于生物检测，特别涉及一种化合物对胰岛素分泌刺激效应的检测方法。

背景技术：

1、代谢综合征是一组以胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病、高血脂、高血压等一系列临床症状为特征的代谢异常症候群。伴随人民生活水平的提高，多种代谢异常疾病，如糖尿病、肥胖、高脂血症等发病率越来越高。胰岛素抵抗，即机体对胰岛素的敏感性和(或)反应性降低，是2型糖尿病等ms共同的主要的病理生理基础。

2、目前，胰岛细胞一般需要进行体外实验和体内实验，分析胰岛素分泌和代谢途径中的基因表达变化及其对葡萄糖刺激的响应。同时，采用药物干预手段，探究对胰岛素分泌的药理作用和潜在机制，寻找新的治疗靶点和药物，因此本发明提出一种化合物对胰岛素分泌刺激效应的检测方法，为胰岛素分泌刺激效应提供新的思路和方向。

3、因此，本着求好的精神及理念，并由专业的知识、经验的辅助，以及在多方巧思、试验后，方创设出本发明，特再提供一种化合物对胰岛素分泌刺激效应的检测方法。

技术实现思路

1、本发明提出一种化合物对胰岛素分泌刺激效应的检测方法，解决了现有技术中的问题。

2、本发明的技术方案是这样实现的：一种化合物对胰岛素分泌刺激效应的检测方法，包括如下步骤：

3、s1：pbs溶液的配制，称取naci8.0g、kci0.2g、na2hpo4·h01.5 g、khpo40.2g，倒入盛有800 ml蒸馏水的烧杯中，充分溶解，调整ph为7.4后准确定容至1000ml；

4、s2：培养基的配制，将10.0gdmem(低糖/高糖)干粉培养基溶于1l的去离子水中，加入3.7g碳酸氢钠，充分溶解，调整ph值至7.0，再加入青霉素(终浓度为100u/ml)和链霉素(终浓度为100μg/ml)，过滤除菌后，4℃保存备用。使用前加入胎牛血清，配成浓度为含10%胎牛血清的dmem(低糖/高糖)完全培养基；

5、0.25%胰酶的配制：准确称取0.25 g胰酶,充分溶于100mipbs中，放置于4℃过夜，用过滤除菌，-20 ℃保存备用；

6、s3：四甲基偶氮唑盐溶液的配制，称取250 mgmtt，用pbs溶解，制成5mg/ml溶液，过滤除菌，4℃备用；

7、s4：细胞培养，含10%胎牛血清、双抗(100u/ml青霉素与100g/ml链霉素)的培养液，置于5% co2，37 ℃培养箱内进行培养。

8、作为优选的实施方式，所述0.25%胰酶的配制在使用前需恢复至常温。

9、作为优选的实施方式，所述培养基需通过脂肪细胞维持培养3-4d，出现大量脂滴堆积后，诱导形成脂肪细胞，将脂肪细胞用pbs清洗3遍，加入无血清的低糖dmem培养基，饥饿处理12小时后，加入0-500nm cxw预处理3小时，用pbs清洗3遍后，加入2-nbdg摄取液进行葡萄糖摄取实验，继续在培养箱内培养1h，小心吸取上清液，用荧光酶标仪进行检测。

10、作为优选的实施方式，所述低糖dmem培养基对细胞饥饿处理24h，加入化合物cxw预处理6h去除培养基，在通过sds裂解液加入细胞样品中裂解10min，并进行离心，然后测定蛋白浓度。

11、作为优选的实施方式，所述细胞培养需传代，细胞贴壁生长至80-90%汇合时，吸弃去培养液，用无菌pbs洗涤细胞1-2次，加入1ml消化液，消化贴壁细胞2-3分钟，吸去胰蛋白酶，并加入少量完全培养基，用吸管轻轻吹打使细胞分散成单细胞悬液，并以均匀的密度接种于新的培养瓶中，加入适量培养液继续进行培养。

12、作为优选的实施方式，所述消化液为含0.25%胰蛋白酶和0.02%edta-na。

13、采用了上述技术方案后，发明的有益效果是：化合物cxw对细胞样品预处理后，通过sds裂解液加入细胞样品中裂解、离心测定的蛋白浓度变化，以实现化合物是否具有潜在的胰岛素分泌刺激效应；

14、化合物cxw通过作用于体内/细胞内ptp1b，致使ptp1b的活性降低，从而增强胰岛素信号通路的活性，最终增强胰岛素刺激状态下机体/细胞的胰岛素生物学效应。

技术特征：

1.一种化合物对胰岛素分泌刺激效应的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种化合物对胰岛素分泌刺激效应的检测方法，其特征在于，所述0.25%胰酶的配制在使用前需恢复至常温。

3.根据权利要求1所述的一种化合物对胰岛素分泌刺激效应的检测方法，其特征在于，所述培养基需通过脂肪细胞维持培养3-4d，出现大量脂滴堆积后，诱导形成脂肪细胞，将脂肪细胞用pbs清洗3遍，加入无血清的低糖dmem培养基，饥饿处理12小时后，加入0-500nmcxw预处理3小时，用pbs清洗3遍后，加入2-nbdg摄取液进行葡萄糖摄取实验，继续在培养箱内培养1h，小心吸取上清液，用荧光酶标仪进行检测。

4.根据权利要求1所述的一种化合物对胰岛素分泌刺激效应的检测方法，其特征在于，所述低糖dmem培养基对细胞饥饿处理24h，加入化合物cxw预处理6h去除培养基，在通过sds裂解液加入细胞样品中裂解10min，并进行离心，然后测定蛋白浓度。

5.根据权利要求1所述的一种化合物对胰岛素分泌刺激效应的检测方法，其特征在于，所述细胞培养需传代，细胞贴壁生长至80-90%汇合时，吸弃去培养液，用无菌pbs洗涤细胞1-2次，加入1ml消化液，消化贴壁细胞2-3分钟，吸去胰蛋白酶，并加入少量完全培养基，用吸管轻轻吹打使细胞分散成单细胞悬液，并以均匀的密度接种于新的培养瓶中，加入适量培养液继续进行培养。

6.根据权利要求5所述的一种化合物对胰岛素分泌刺激效应的检测方法，其特征在于，所述消化液为含0.25%胰蛋白酶和0.02%edta-na。

技术总结本发明提出了一种化合物对胰岛素分泌刺激效应的检测方法，属于生物检测技术领域，包括如下步骤：PBS溶液的配制；培养基的配制；0.25%胰酶的配制；四甲基偶氮唑盐溶液的配制以及细胞培养，培养基为浓度含10%胎牛血清的DMEM(低糖/高糖)完全培养基；通过低糖DMEM培养基对细胞饥饿处理24h，加入化合物CXW预处理6h去除培养基，在通过SDS裂解液加入细胞样品中裂解10min，并进行离心，然后测定蛋白浓度，以实现化合物是否具有潜在的胰岛素分泌刺激效应；化合物CXW通过作用于体内/细胞内PTP1B，致使PTP1B的活性降低，从而增强胰岛素信号通路的活性，最终增强胰岛素刺激状态下机体/细胞的胰岛素生物学效应。技术研发人员：杨优受保护的技术使用者：武汉科技大学技术研发日：技术公布日：2024/9/9