一种土壤微生物DNA提取试剂盒及提取方法和应用与流程

本技术涉及生物，尤其涉及一种土壤dna提取试剂盒及提取方法和应用。

背景技术：

1、土壤中的微生物是土壤生态系统的重要组成部分，对于土壤的健康和生产力具有关键作用。微生物在土壤中扮演着多种重要角色，其提取和研究对于了解土壤生态系统的功能和过程至关重要。通过提取土壤微生物并筛选具有生物控制特性的菌株，可以开发生物农药和生物修复剂，这些微生物产品可以替代传统的化学农药和修复方法，减少环境污染和生态风险，对害虫、病原体和有害化合物进行生物防治和生物修复有着重要意义。所以土壤中微生物的提取对于了解土壤生态系统的功能、评估土壤质量、指导肥力管理、开发生物防治和生物修复产品，以及监测土壤健康非常重要，为实现可持续农业和环境管理提供了基础数据和科学依据。土壤中的微生物在实验室中很难培养，首先土壤中微生物间相互作用复杂，它们与土壤中的其他微生物、植物根系、土壤颗粒等相互作用，导致土壤的复杂性和多样性；其次许多土壤微生物对于生长和繁殖需要特定的营养物质、微量元素、特定的ph值、氧气浓度、温度和湿度等条件；此外，土壤中的某些微生物具有慢生长特性，繁殖周期较长，需要较长时间才能形成可见的菌落，一些微生物在土壤中处于休眠状态，以适应不利的环境条件。由于以上原因使得我们很难提供相应的培养条件，从而限制了土壤微生物的培养。根据最新的研究，土壤中的微生物的绝大多数（可能超过99%）是未知和未培养的。这些微生物被称为“暗物质微生物”（microbial dark matter）。所以实验室培养的方法对于土壤微生物群落的研究非常有限。

2、由于分子生物学的兴起，通过分析土壤中的16s rrna基因或其他标记基因的序列，可以确定微生物的物种组成和丰度，为土壤生态系统的研究和保护提供重要依据。还可以用于分析土壤微生物的功能基因，例如关键的嗜热菌基因、氮循环基因、有机物降解基因等，这些功能基因的存在和丰度可以提供土壤中特定微生物群落功能的信息，从而揭示土壤生态系统中的关键生态过程，如养分循环、有机物分解和污染物降解等。通过定期采集土壤样品并提取高质量的dna，可以跟踪微生物群落的变化，如季节性变化、环境干扰和管理措施的影响等。所以土壤中dna的提取质量对于后续研究有重要意义。

3、然而提取土壤中的微生物的基因组是一个巨大的挑战。由于土壤是一个高度复杂的环境，其中包含了多种有机和无机成分，如植物残渣、微生物、土壤颗粒、黏土和矿物质等。这些成分的存在使得从土壤中提取基因组变得困难，会干扰dna提取过程，降低提取的dna质量和纯度。土壤微生物大多数是一些真菌或革兰氏阳性菌，通常具有坚硬的细胞壁，这使得从细胞内提取dna变得困难。此外，土壤中存在一些扩增抑制物质，如多酚类物质、黄酮类化合物和金属离子等，它们具有抑制dna提取和pcr反应的作用。这些抑制物质可能会降低提取到的dna的质量和纯度，并干扰后续的分子生物学分析。

4、从以上可看出土壤中微生物dna的用途非常广泛，尤其是土壤健康监测和生态功能评估方面，需要大量采集不同的土壤样本并提取dna，所以如何提取高质量dna并且将土壤中微生物dna的提取高通量自动化、提取均一化成为挑战。比较常见的土壤中微生物基因组的提取方法有sds高盐法、sds-酚氯仿抽提法、溶菌酶裂解法，这些不同的裂解方法搭配离心柱或者磁珠法进行dna纯化。其中，sds-酚氯仿抽提法提取的dna浓度高，但是浓度大多虚高，含有杂质多，得到的dna对下游实验如建库pcr影响较大；其他裂解方法都需要将土壤裂解完成后进行离心除杂并将上清液转移至新的离心管中，这一步不仅需要实验室配备离心机，而且增加了人工、时间成本。对于需要高纯度dna样品的实验室，离心柱法是一种较好的选择，但必须使用离心机通过认真操作和处理样本，可以获得高质量的dna提取产物，但是在操作上可能需要更多的时间和劳动力。另外，对于需要处理大量土壤样品的实验室，可以考虑使用高通量的dna提取方法，以提高提取效率和通量。磁珠纯化法提取土壤dna虽然提取通量大、纯度高，但是土壤中微生物裂解这一步还需要在离心机上操作，无形中增大了时间成本。以上提取方法均不能做到高通量、简单操作，所以需要开发一种高通量、无需离心去除杂质或转移上清、简便操作的全自动土壤微生物dna提取方法。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明的目的是提供一种高通量、无需离心去除杂质或转移上清、简便操作、可用于全自动提取器械的土壤微生物dna提取试剂盒及提取方法和应用。

2、一方面，本技术提供了一种土壤微生物dna提取试剂盒，所述试剂盒包括：裂解结合组分、蛋白酶、第一除杂磁珠、纯化磁珠、第二除杂磁珠、第一漂洗液、第二漂洗液、洗脱液；所述第一除杂磁珠为不吸附核酸的除杂磁珠。

3、在一种优选的实施方式中，所述蛋白酶为蛋白酶k。可以理解的是，本领域技术人员可以根据实际情况选择本领域常用蛋白酶或能够酶解与核酸结合的组蛋白的其他酶，只要是能够实现核酸与组蛋白的分离即可。

4、优选的，所述试剂盒还包括10-50 mg/ml蛋白酶k。

5、在一种优选的实施方式中，所述第二除杂磁珠购买自firemag one-step pcrinhibitor removal magnet beads，货号：bc101；纯化磁珠购自百迈格，货号：bmq81019-500。本领域技术人员可知，此处仅为一种可行的实施方式，操作人员可根据实际情况选择制备或购买纯化磁珠或第二除杂磁珠，只要磁珠能够完成本技术所述的纯化或除杂作用即可。

6、进一步地，所述裂解结合组分包括研磨珠和裂解结合液；优选的，所述研磨珠为氧化锆研磨珠；优选的，所述裂解结合液包括异硫氰酸胍、tris、磷酸钠缓冲液、n-月桂酰肌氨酸钠、十六烷基三甲基溴化铵；更优选的，所述裂解结合液包括3-5 m异硫氰酸胍、10-50 mmtris、100-300 mm磷酸钠缓冲液、0.1-0.5m n-月桂酰肌氨酸钠、0.05-1%十六烷基三甲基溴化铵。

7、优选的，tris的ph值为7.0-8.0。

8、进一步地，所述第一漂洗液包括异硫氰酸胍、tris、氯化钠；优选的，所述第一漂洗液包括1-3 m异硫氰酸胍、10-50 mm tris、10-50 mm氯化钠。

9、优选的，tris的ph值为7.0-8.0。

10、进一步地，所述第二漂洗液包括乙醇；优选的，所述第二漂洗液包括60％-80%乙醇。

11、进一步地，所述洗脱液包括10-50 mm tris（ph=7.0-8.0）。

12、进一步地，所述第一除杂磁珠的制备方法包括：将六水合三氯化铁溶解于乙二醇中，搅拌后加入分散剂，升温搅拌后加入沉淀剂，密封加热反应，冷却即得第一除杂磁珠。

13、进一步地，所述分散剂为聚乙二醇4000；和/或，所述沉淀剂为乙酸钠。

14、在一种优选的实施方式中，所述第一除杂磁珠的制备方法包括如下步骤：

15、步骤一、将六水合三氯化铁溶解于乙二醇中，搅拌30-60 min，得到铁溶液；

16、步骤二、将聚乙二醇4000加入铁溶液中，升温至80℃-100℃搅拌30-60 min后，加入乙酸钠搅拌30-60 min，密封到100℃-300℃加热，反应6-10 h后，冷却至室温，即得第一除杂磁珠。

17、在一种优选的实施方式中，所述第一除杂磁珠的制备方法包括：

18、步骤一、将2.7 g六水合三氯化铁溶解于100 ml乙二醇中，搅拌30 min，得到铁溶液；

19、步骤二、将1.5 g聚乙二醇4000加入铁溶液中，升温至90℃搅拌30 min后，加入2.0g乙酸钠搅拌30 min，密封到200℃加热，反应8 h后，冷却至室温，去离子水洗涤3次，将浓度标定为100 mg/ml即得第一除杂磁珠。

20、采用上述方法制备的第一除杂磁珠不标记任何基团，所以理论上无法吸附核酸。

21、上述除杂磁珠制备对除杂的步骤很重要，其决定了杂质处理的是否彻底。

22、一般来说，在磁珠法反应体系中，dna分子会由线性压缩成球状，dna在一定浓度的peg存在条件下，在nacl或mgcl2盐离子条件下，dna分子构象会发生急剧变化，会暴露出磷酸骨架上大量的带负电荷的磷酸基团，与表面带负电荷的羧基-cooh磁珠结合。这种负负电荷间的作用是依托带正电荷的盐离子的作用（如na+）来进行的，带负电磷酸基团借由解离的盐离子（如na+）与羧基形成“阴离子-阳离子-阴离子”的盐桥结构，使dna被特异性吸附到羧基磁珠表面。而当反应缓冲液被弃除后，加入水性分子，会快速充分水化核酸分子，解除三者之间的离子相互作用，使吸附到磁珠上的核酸分子被纯化出来。利用磁珠的磁性，可通过外加磁场进行收集洗脱。

23、基于以上磁珠与dna的相互作用，本技术制备除杂磁珠的过程中不标记任何基团，搭配本发明中裂解液的组分，能够有效降低磁珠吸附核酸的盐桥作用，除杂磁珠与土壤中大的杂质颗粒混合后，在外加磁场的作用下，除杂磁珠可以被吸附到磁力架或磁棒上，丢弃除杂磁珠，保留上清，可以将磁珠与结合的土壤颗粒等固体杂质一起分离出来，从而实现对泥沙杂质（包含研磨珠）的去除。达到免去离心操作即可除杂，省去大量人工操作，有助于实现土壤提取的自动化。具体原理见图4。

24、进一步地，所述试剂盒包括：氧化锆研磨珠0.1-1 g、裂解结合液500-700 µl、10-50 mg/ml蛋白酶、第一除杂磁珠80-200 μl、纯化磁珠10-50 μl、第二除杂磁珠10-20 μl、第一漂洗液500-900 µl、第二漂洗液500-900 µl、洗脱液100-200 µl。

25、在一种优选的实施方式中，所述试剂盒包括：裂解结合组分（氧化锆研磨珠0.5 g、裂解结合液700 µl）、20 mg/ml蛋白酶、第一除杂磁珠200 μl、纯化磁珠20 μl、第一漂洗液800 µl、第二漂洗液800 µl、洗脱液105 µl。

26、其中，裂解结合组分包括0.1 mm的氧化锆研磨珠和裂解结合液，裂解结合液包括5m异硫氰酸胍、50 mm tris（ph=8.0）、200 mm磷酸钠缓冲液、0.5m n-月桂酰肌氨酸钠、1%十六烷基三甲基溴化铵；第一漂洗液包括3 m异硫氰酸胍、50 mm tris（ph=8.0）、25 mm氯化钠；第二漂洗液包括75%乙醇；洗脱液包括10 mm tris（ph=8.0）。

27、另一方面，本技术还提供了所述的试剂盒在全自动土壤微生物dna提取中的应用。

28、另一方面，本技术还提供了所述的试剂盒全自动提取土壤微生物dna的方法，所述方法包括如下步骤：

29、步骤一、将土壤样本与裂解结合组分、蛋白酶震荡混匀，孵育后加入第一除杂磁珠将杂质吸附并丢弃除杂磁珠，获得裂解液样本；

30、步骤二、利用纯化磁珠处理裂解液样本，使其结合已经析出的dna；

31、步骤三、使用第一漂洗液和第二漂洗液漂洗结合dna的纯化磁珠；

32、步骤四、干燥后使用洗脱液分离纯化磁珠与dna；

33、步骤五、利用第二除杂磁珠对dna进行除杂。

34、在一种优选的实施方式中，所述方法包括如下步骤：

35、步骤一、将土壤样本与裂解结合组分、蛋白酶k在涡旋震荡仪上震荡混匀3min，使用金属浴70℃孵育10 min，期间颠倒混匀3-5次，孵育结束后第一除杂磁珠与样本振荡混合10 min，将第一除杂磁珠吸附到磁力架或磁棒上，取上清，再次重复第一除杂磁珠的步骤，获得裂解液样本；

36、步骤二、取纯化磁珠与裂解液样本震荡混匀1 min，静置10 min，期间震荡混匀3-5次，吸弃上清，使纯化磁珠结合已经析出的dna；

37、步骤三、使用第一漂洗液和第二漂洗液漂洗结合dna的纯化磁珠；

38、步骤四、干燥后将洗脱液与纯化磁珠震荡混合，室温下孵育10 min；

39、步骤五、继续加入第二除杂磁珠，震荡混匀1 min，室温下孵育2 min后，放置在磁力架上静置2 min，上清即为土壤微生物dna。

40、在一种优选的实施方式中，所述提取土壤微生物dna的方法可借助凡知fireautop96高通量全自动提取仪进行。

41、另一方面，本技术还提供了所述的试剂盒或所述的方法在全自动提取土壤微生物dna中的应用。

42、另一方面，本技术还提供了一种装置，所述装置可利用所述的试剂盒全自动提取土壤微生物dna或执行所述的方法全自动提取土壤微生物dna。

43、如上所述，本技术还提供了一种全自动提取土壤微生物dna的装置。

44、优选的，所述装置为凡知fireauto p96高通量全自动提取仪。

45、所述装置的板位设置如下所示：

46、板位1：空板和磁棒套；

47、板位2：水和第一除杂磁珠；

48、板位3：裂解结合组分；

49、板位4：水和第一除杂磁珠；

50、板位5：第一漂洗液；

51、板位6：第二漂洗液和纯化磁珠；

52、板位7：洗脱液；

53、板位8：水和第二除杂磁珠。

54、所述装置执行的程序如下表所示:

55、

56、本技术提取土壤微生物dna的方法中采用三种磁珠联用，其优势在于①第一除杂磁珠的作用是将除杂磁珠第一次与样本进行混合，第一除杂磁珠与大的杂质颗粒混合后，在外加磁场的作用下，磁珠可以被吸附到磁力架或磁棒上，而其他无关的杂质和溶液可以被移除。通过去除磁力场，可以将磁珠与结合的杂质一起分离出来，从而实现对80%-90%泥沙杂质或沉淀（包含研磨珠）的除去。将第一除杂磁珠第二次与样本进行混合，可将样本中剩余10%-20%的沉淀（包含研磨珠）和杂质去除干净，从而达到免去离心操作即可除杂，省去大量人工操作。②经过特殊修饰的纯化磁珠可以特异性结合已经析出的dna。③第二除杂磁珠与dna溶液进行混合，可去除残留在溶液中的pcr抑制剂，如多酚化合物、腐殖酸/黄腐酸、酸性多糖、肝素、洗涤剂等。

57、综上，经过三种磁珠联用，除杂磁珠可以有效吸附和去除这些大颗粒杂质，又将洗脱后的dna进行杂质吸附步骤，纯化磁珠可以高效吸附裂解后的dna，从而可以实现土壤dna的高纯度、快速、高通量提取。全程时间不超过90分钟即可完成96个土壤样本中微生物dna的提取，且可选择机械辅助提取，实现全程无需人工干预高效提取土壤dna，大大提高了提取效率和样品处理的一致性，实现土壤dna提取的自动化。

58、另一方面，本技术还提供了所述的试剂盒或所述的方法在提高土壤微生物dna提取纯度、提取浓度和/或提取效率中的应用。

59、本发明具有如下有益效果：

60、1. 本发明提供的土壤微生物dna的提取试剂盒中含有经过特殊制备的除杂磁珠，能够有效降低磁珠吸附核酸的盐桥作用，可以有效吸附裂解完成后的土壤以及其他大的杂质颗粒，而不吸附微生物dna，从而保证了dna的得率和提取效率。

61、2. 本发明提供的提取方法，结合p96全自动提取仪，将土壤微生物dna提取试剂做预分装并设计提取程序，整合整个提取过程，从前处理到上仪器提取，全程时间不超过90分钟即可提取96个土壤样本，提取过程中无需人工，可进行自动化高通量提取。

62、3. 采用本发明方法，将洗脱完成的土壤微生物dna使用除杂磁珠进行二次纯化，可去除残留的腐殖酸、多酚等pcr抑制剂，进而使得最终获得的dna更加纯净。

63、4. 采用本发明中裂解结合液，将细胞裂解和dna纯化的步骤合并到一个步骤中，同时使用裂解结合液来实现细胞裂解并且促进dna的析出，使dna保持稳定的形式与纯化磁珠进行结合。漂洗液有助于去除样本中残留的蛋白、多酚等杂质，漂洗液有助于去除残留的胍盐等杂质。裂解结合液与其他缓冲体系的协同作用保证了提取dna的完整性。

64、5. 本发明可以做到高通量、无需离心去除杂质或转移上清、简便操作的土壤微生物dna的提取。提取后的dna可以用于分析土壤中的16s rrna基因或其他标记基因的序列，可以确定微生物的物种组成和丰度，为土壤生态系统的研究和保护提供重要依据。