基于大肠杆菌表达体系的系列司美格鲁肽核心29肽融合分子及其应用的制作方法

本发明涉及生物，具体涉及基于大肠杆菌表达体系的系列司美格鲁肽核心29肽融合分子及其应用。

背景技术：

1、胰高血糖素样肽-1受体激动剂（glucagon-like peptide-1, glp1）,是一种主要由肠道l细胞产生的激素。glp1结合并激活glp1受体后，下游信号通路通过增强胰岛素分泌，抑制胰高血糖素分泌，延缓胃排空以及通过中枢性食欲抑制作用减少进食量，进而达到控制血糖以及控制体重的临床效果。

2、glp1在体内容易被dppv酶降解而造成其半衰期特别短。要想获得该分子的成药性，必须解决其体内半衰期问题。围绕半衰期提升问题，生物学家和蛋白质化学家进行了大量的基础研究工作。自从2005年第一个glp1类似物（exenatide）上市以来，目前共有7款glp1类似物药物上市，并且有多个药物在临床研发的不同阶段。目前上市的glp1类似物药物主要通过化学合成、酵母发酵、哺乳动物发酵等工艺路线生产制备。

3、在上述项目中，司美格鲁肽无疑是其中的佼佼者，大量的临床验证证明其在降血糖、减体重、心脑血管疾病和肾病控制方面，都有显著的临床获益。根据专利和公开文献报道，原研药厂家诺和诺德通过酵母发酵法生产司美格鲁肽的核心多肽（29肽），然后通过体外化学修饰方法在n端进行haib和r20氨基酸上进行脂肪酸修饰，最终获得司美格鲁肽的有效分子。司美格鲁肽的分子实体专利将在2026年过期。作为减肥和降糖的“明星”分子，吸引了大量的仿制药企业加入到该药物的仿制中。目前的仿制药企业，主要采用化学全合成法和大肠杆菌生物发酵结合体外化学修饰法进行生产（cn115197312、cn115505035、115322250、cn114292338、cn11487414、cn110305223）。这两种方法各有利弊，化学修饰法对设备要求较低，传统的多肽合成企业均具备工作能力，但是化学合成法在纯度、规模效益、成本方面具有弱势。大肠杆菌发酵法，需要构建融合表达体系，建立复杂的下游回收工艺、酶切工艺、层析工艺。尽管如此，大肠杆菌表达体系具有发酵工艺简单、成本便宜、可规模化放大等特点，因此，基于大肠杆菌生物发酵结合体外化学修饰工艺，将是未来降低司美格鲁肽原料药价格，更好服务患者的有效途径。

4、大肠杆菌表达体系表达多肽，一般采用如下技术路线：1）将glp1多肽的编码基因与融合标签的基因融合获得融合蛋白的表达基因并连接到表达载体，表达载体转化大肠杆菌表达菌株并实现融合蛋白的高效表达；2）作为包涵体或者上清表达的融合蛋白经下游回收工艺回收后进行酶切并获得29肽粗品（常用的酶切位点包括sumo酶、ek酶、kex2、羧肽酶等）；3）29肽经过下游层析纯化并获得29肽纯品；4）29肽纯品经过体外化学修饰方法在n端进行haib和r20氨基酸上进行脂肪酸修饰，最终获得司美格鲁肽的有效分子粗品；5）司美格鲁肽粗品经过最终纯化和制剂获得液体或者口服制剂的最终产品。在上述工艺中，29肽的融合表达量和下游纯化的产量是降低产品生产成本与提高竞争力的关键。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供基于大肠杆菌表达体系的系列司美格鲁肽核心29肽融合分子及其应用。

2、第一方面，本发明要求保护一种融合蛋白。

3、本发明所要求保护的融合蛋白为如下任一：

4、（a1）由如下a1）-a3）所示三部分组成：

5、a1）促进包涵体表达标签；

6、a2）司美格鲁肽核心29肽；

7、a3）用于连接a1）和a2）的蛋白酶特异性识别序列；

8、（a2）在（a1）所示融合蛋白的a1）部分中增加促进表达标签后得到的融合蛋白。

9、其中，所述促进包涵体表达标签选自如下b1）或/和b2）：

10、b1）seq id no.19或对seq id no.19仅进行c端截断或对seq id no.19同时进行c端和n端截断后所示多肽；其中，seq id no.19的第7位x为丝氨酸（s）或缬氨酸（a）；

11、b2）seq id no.20所示多肽。

12、所述促进表达标签选自如下c1）-c3）中的任意一个或两个或三个：

13、c1）seq id no.21所示多肽；

14、c2）seq id no.22所示多肽；

15、c3）氨基酸序列为nhk的多肽。

16、所述司美格鲁肽核心29肽的氨基酸序列为seq id no.1。

17、进一步地，在所述b1）中，对seq id no.19仅进行c端截断后所得多肽的氨基酸序列为seq id no.19的第1-38位。

18、进一步地，在所述b1）中，对seq id no.19同时进行c端和n端截断后所得多肽的氨基酸序列为seq id no.19的第16-38位。

19、在本发明的一个实施案例中，所述司美格鲁肽核心29肽位于c端。

20、进一步地，在所述a3）中，所述蛋白酶为肠激酶（ek酶），其特异性识别序列为ddddk。当然，所述蛋白酶也可以为kex2酶（酶切位点kr,rr,rk）、factor xa酶（酶切位点idgr）等，不同的蛋白酶对应不同的特异性识别序列。

21、在本发明的具体实施案例中，所述融合蛋白为如下任一：

22、（b1）氨基酸序列如seq id no.10所示（glp123）；

23、（b2）氨基酸序列如seq id no.7所示（glp120）；

24、（b3）氨基酸序列如seq id no.11所示（glp125）；

25、（b4）氨基酸序列如seq id no.6所示（glp18）；

26、（b5）氨基酸序列如seq id no.9所示（glp122）；

27、（b6）氨基酸序列如seq id no.2所示（glp11）；

28、（b7）氨基酸序列如seq id no.3所示（glp13）；

29、（b8）氨基酸序列如seq id no.4所示（glp15）；

30、（b9）氨基酸序列如seq id no.5所示（glp17）；

31、（b10）氨基酸序列如seq id no.8所示（glp121）；

32、（b11）氨基酸序列如seq id no.12所示（glp112）；

33、（b12）氨基酸序列如seq id no.13所示（glp1202）；

34、（b13）氨基酸序列如seq id no.14所示（glp1212）；

35、（b14）氨基酸序列如seq id no.15所示（glp1222）；

36、（b15）氨基酸序列如seq id no.16所示（glp1232）；

37、（b16）氨基酸序列如seq id no.17所示（glp1252）。

38、第二方面，本发明要求保护能够表达前文第一方面中所述融合蛋白的核酸分子。

39、所述核酸分子可以是dna，如cdna或重组dna；也可以是rna，如mrna。

40、在本发明的具体实施案例中，所述核酸分子为如下任一所示dna：

41、（c1）核苷酸序列如seq id no.23所示（glp123的编码基因）；

42、（c2）核苷酸序列如seq id no.24所示（glp120的编码基因）；

43、（c3）核苷酸序列如seq id no.25所示（glp125的编码基因）；

44、（c4）核苷酸序列如seq id no.26所示（glp18的编码基因）；

45、（c5）核苷酸序列如seq id no.27所示（glp122的编码基因）；

46、（c6）核苷酸序列如seq id no.28所示（glp11的编码基因）；

47、（c7）核苷酸序列如seq id no.29所示（glp13的编码基因）；

48、（c8）核苷酸序列如seq id no.30所示（glp15的编码基因）；

49、（c9）核苷酸序列如seq id no.31所示（glp17的编码基因）；

50、（c10）核苷酸序列如seq id no.32所示（glp121的编码基因）；

51、（c11）核苷酸序列如seq id no.33所示（glp112的编码基因）；

52、（c12）核苷酸序列如seq id no.34所示（glp1202的编码基因）；

53、（c13）核苷酸序列如seq id no.35所示（glp1212的编码基因）；

54、（c14）核苷酸序列如seq id no.36所示（glp1222的编码基因）；

55、（c15）核苷酸序列如seq id no.37所示（glp1232的编码基因）；

56、（c16）核苷酸序列如seq id no.38所示（glp1252的编码基因）；

57、（c17）与（c1）-（c16）中任一所示核苷酸序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上或者80%以上同一性且编码所述融合蛋白的dna分子。

58、上述核酸分子中，可使用国际互联网上的同一性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gapexistence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85（缺省值）并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值（%）。

59、上述核酸分子中，所述95％以上的同一性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、93％、94%的同一性。所述85％以上的同一性可为至少86％、87％、88％、89%的同一性。所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、83％、84%的同一性。

60、第三方面，本发明要求保护含有前文第二方面中所述核酸分子的表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系。

61、所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述核酸分子的dna，该dna不但可包括启动所述核酸分子转录的启动子，还可包括终止所述核酸分子转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

62、在本发明的一个实施案例中，所述重组载体为将所述核酸分子克隆到pet-28a(+)表达载体后所得。具体为将所述核酸分子克隆到pet-28a(+)质粒的酶切位点ncoi和xhoi之间后所得。

63、在本发明的一个实施案例中，所述重组菌为将所述核酸分子或所述表达盒或所述重组载体导入大肠杆菌后所得。

64、第四方面，本发明要求保护前文第一方面中所述融合蛋白或前文第二方面中所述核酸分子或前文第三方面中所述表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系在制备司美格鲁肽核心29肽中的应用；所述司美格鲁肽核心29肽的氨基酸序列为seq id no.1。

65、第五方面，本发明要求保护一种制备司美格鲁肽核心29肽的方法。

66、本发明要求保护的制备司美格鲁肽核心29肽的方法，可包括如下步骤：对前文第三方面中所述重组菌进行发酵培养，收集菌体后进行破碎，得到包涵体沉淀；对所述包涵体沉淀进行溶解、肠激酶酶切，得到司美格鲁肽核心29肽。

67、其中，进行所述发酵培养可按照包括如下步骤的方法进行：将所述重组菌在lb培养基中32℃/220rpm震荡培养8～12h，得到种子液；将所述种子液接入装有液体发酵培养基(如fcm培养基)的三角瓶，进一步培养8～12h得到二级种子液；然后将所述二级种子液接入装有6l的基础发酵培养基(如fcm培养基)的10l反应器中，37℃进行培养，控制初始转速300rpm、通气速度6l/h、ph7.0（在发酵过程中，通过氨水和10%硫酸控制ph）；设定溶氧30%[在发酵过程中，通过持续提升转速（转速300-800r/min之间调整）以控制溶氧]。每间隔2h测定一次od600，基于测量数据绘制生长曲线；当发酵液od600值达到20～30时，开始通氧（3l/h）并控制通气速度（2l/h），防止通氧停顿时排气口返流杂菌造成污染；当发酵液od600的值达到30～40时，开启补料（补料培养基：275g/l甘油、225g/l酵母提取物）；当发酵液od600的值达到80～100时，加入终浓度为0.2mm的iptg进行诱导，36℃下诱导12～16h后停止发酵。4000rpm/30min离心收集菌体。

68、在本发明中，基于大肠杆菌表达体系，开发了配套的高密度发酵工艺。该工艺具有以下特点：1）富营养培养基(fcm培养基)和配套的补料培养基满足大肠杆菌较高的生长速率；2）结合上述培养基的后段通氧工艺实现大肠杆菌最高od600接近250的高密度发酵；3）结合上述培养基的后段通氧工艺实现大肠杆菌批次化培养时间<24h，极大降低了发酵的能耗成本。

69、本发明有益效果：

70、1）通过增加促进表达标签，提高核心29肽的融合表达量和下游纯化的产量，是降低产品生产成本与提高竞争力的关键。2）大肠杆菌表达体系具有发酵工艺简单、成本便宜、可规模化放大等特点。3）基于大肠杆菌生物发酵结合体外化学修饰工艺，来降低司美格鲁肽原料药价格，为患者提供更好的服务。