一种霉菌脱氢物的制备方法与流程

本发明涉及生物工程制药领域，更具体地，涉及一种霉菌脱氢物的制备方法。

背景技术：

1、霉菌脱氢物(1,2-dehydrogenated-11-hydroxy-16,17-expoxy proge-stenone)是制备糖皮质激素地夫可特的重要中间体。地夫可特具有消炎、抗过敏、增加糖原异生等作用，其功效相当于泼尼松龙的10-20倍，氢化可的松的40倍。目前，工业上采用两步发酵法制备霉菌脱氢物：先用沃氏氧化物(简称沃氏物)通过黑根霉、赭曲霉或绿僵菌11α羟基化制备霉菌氧化物，霉菌氧化物再通过节杆菌或诺卡氏菌c1,2位脱氢制备霉菌脱氢物，反应过程如下。中国专利cn201310105874.9、201210594836.x、202110915149.2等提供了两步发酵制备霉菌脱氢物的方法。

2、

3、沃氏物制备霉菌氧化物的步骤一直是行业内的难点，因为此发酵步骤转化率低、劳动效率低且生产成本高。目前生产厂家一般使用黑根霉发酵制备霉菌氧化物，具有总收率稳定的优点，但是转化率只38-55％，需经过6-7次提取和6-7次精制后得到霉菌氧化物精品，精制一次收率38-45％，提取精制效率低，溶剂用量大，操作繁琐；使用赭曲霉或绿僵菌转化率为60-70％，对比黑根霉转化率虽有所提高，但会产生色素或杂质积累，生产厂家一般不采用。

4、基于此，有必要开拓一种新方法来解决目前工业化生产霉菌脱氢物过程中存在的问题。

技术实现思路

1、基于现有技术中存在的上述技术问题，发明人研究中发现，沃氏物用传统的简单节杆菌或诺卡氏菌不能c1,2位脱氢转化，但是用大肠杆菌工程菌产生的脱氢酶，转化率能达98％以上且稳定性好。沃氏脱氢物再用黑根霉或赭曲霉11α羟基化，转化率可达85％以上且收率稳定。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

3、一种霉菌脱氢物的制备方法，其反应过程如下：

4、

5、先对沃氏氧化物进行c1,2位脱氢得到沃氏脱氢物，然后使沃氏脱氢物进行11α羟基化反应，得到霉菌脱氢物。

6、具体地，包括以下步骤：

7、s1、将沃式物、电子受体、助溶剂和c1,2位脱氢酶工程菌催化液投入第一缓冲液中进行反应，得到沃式脱氢物粗品；

8、s2、将沃式脱氢物粗品投入赭曲霉发酵培养液中，进行转化，得到霉菌脱氢物。

9、在一些实施方式中，步骤s1中，所述电子受体为2,6-二氯酚靛酚(dcpip)和/或酚嗪硫酸甲酯(pms)。

10、在一些实施方式中，步骤s1中，所述助溶剂为dmso、异丙醇、叔丁醇、正丙醇中的至少一种。

11、在一些实施方式中，步骤s1中，所述第一缓冲液包括ph＝6的磷酸盐、醋酸钠、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中的一种。

12、在一些实施方式中，步骤s1中，所述c1,2位脱氢酶工程菌为大肠杆菌工程菌，其制备方法为：以c1,2位脱氢酶蛋白序列为基础全基因合成相应基因序列，连接在质粒载体上，然后转入大肠杆菌感受态细胞中，得到大肠杆菌工程菌；具体地，所述质粒由上海生工生物工程有限公司代加工。

13、在一些实施方式中，所述c1,2位脱氢酶氨基酸序列如实例1中seq id no.1所示；所述基因序列如实例1中seq id no.2所示。

14、在一些实施方式中，所述质粒载体为pet系列载体。

15、在一些实施方式中，所述大肠杆菌为escherichia coli bl21(de3)。

16、在一些实施方式中，所述工程菌催化液的制备包括以下步骤：

17、将大肠杆菌工程菌接入培养基中，加入终浓度为0.5mm的iptg，在24-28℃、150-200rpm的条件下诱导培养后，收集菌体；用生理盐水清洗菌体后，用ph＝7的第一缓冲液重悬菌体，然后破壁，得到所述工程菌催化液；

18、其中，所述培养基中，按质量百分数计，1l水中，包括：酵母浸粉0.2％-0.4％、甘油0.5％-1.5％、蛋白胨0.2％-0.5％、磷酸二氢钾0.5％-1.2％、磷酸氢二钾0.3％-0.4％、硫酸铵0.2％-0.4％、无水硫酸镁0.03％-0.08％、聚醚消泡剂0.05％-0.1％，用浓度20％氢氧化钠溶液调ph至6.8-7.2。

19、在一些实施方式中，所述赭曲霉菌保藏编号为atcc18500。

20、在一些实施方式中，步骤s2中，具体为：将沃式脱氢物、第二助溶剂、乳化剂投入赭曲霉菌发酵液中，进行反应，得到霉菌脱氢物。

21、在一些实施方式中，所述赭曲霉菌发酵液的制备包括以下步骤：

22、将赭曲霉斜面种子接入无菌发酵培养基中，在26-30℃、160-200rpm条件下培养16-18h，得到赭曲霉发酵培养液。

23、在一些实施方式中，所述赭曲霉菌的发酵培养基中，按质量百分数计，1l水中，包括葡萄糖2％-3％、玉米浆1％-2％、磷酸二氢钾0.02％-0.1％、硫酸镁0.03％-0.06％、吐温(80)0.05％-0.15％、消泡剂0.05％-0.1％，用浓度20％氢氧化钠溶液碱调ph＝5.8-6.0。

24、在一些实施方式中，所述第二助溶剂为1-5％(v/v)的甲醇、乙醇、正丁醇、异丙醇、叔丁醇、dmso中的至少一种。

25、在一些实施方式中，所述乳化剂为吐温80、洗衣粉、sds中的至少一种。

26、相较于现有技术，本发明的有益效果如下：

27、1.本发明通过c1,2位脱氢酶工程菌先对沃式物进行脱氢，使不能被简单节杆菌、诺卡氏菌等转化的沃氏物能被脱氢酶酶催化转化；然后再对沃式脱氢物进行羟基化转化，可以有效提高沃式物的转化率的同时提高霉菌脱氢物的产率。

28、2.通过本发明的方法，使沃式物c1,2脱氢的转化率达到98％以上，且得到的沃氏脱氢物粗品不需提取精制，仅需要过滤烘干直接用于赭曲霉投料；带菌粗品连续投料发酵，简化了操作步骤，节约了溶剂成本。

29、3.用赭曲霉对沃式脱氢物粗品进行生物转化，转化率85％以上，总收率90％左右，较稳定。

30、4.本发明用沃氏氧化物制备霉菌脱氢物，先脱氢后羟化，与传统的先羟化后脱氢相比，避免了沃氏氧化物羟化制备霉菌氧化物步骤转化率低生产成本高的缺点，且先脱氢后羟化采用连续发酵的方法，脱氢物不需要提取精制，极大地减少了生产成本。

技术特征：

1.一种霉菌脱氢物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的霉菌脱氢物的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述电子受体为2,6-二氯酚靛酚和/或吩嗪硫酸甲酯。

3.根据权利要求1所述的霉菌脱氢物的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述助溶剂为dmso、异丙醇、叔丁醇、正丙醇中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的霉菌脱氢物的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述第一缓冲液包括ph＝6的磷酸盐、醋酸钠、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中的一种。

5.根据权利要求1所述的霉菌脱氢物的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述c1,2位脱氢酶工程菌为大肠杆菌工程菌，其制备方法为：以c1,2位脱氢酶蛋白序列为基础全基因合成相应基因序列，连接在质粒载体上，然后转入大肠杆菌感受态细胞中，得到大肠杆菌工程菌。

6.根据权利要求1所述的霉菌脱氢物的制备方法，其特征在于，所述c1,2位脱氢酶氨基酸序列如seq id no.1所示；所述基因序列如seq id no.2所示。

7.根据权利要求1所述的霉菌脱氢物的制备方法，其特征在于，所述质粒载体为pet系列载体；所述大肠杆菌为escherichia coli bl21(de3)。

8.根据权利要求1所述的霉菌脱氢物的制备方法，其特征在于，所述工程菌催化液的制备包括以下步骤：

9.根据权利要求1所述的霉菌脱氢物的制备方法，其特征在于，所述赭曲霉菌保藏编号为atcc18500。

10.根据权利要求1所述的霉菌脱氢物的制备方法，其特征在于，所述赭曲霉菌的培养基中，按质量百分数计，1l水中，包括葡萄糖2％-3％、玉米浆1％-2％、磷酸二氢钾0.02％-0.1％、硫酸镁0.03％-0.06％、吐温(80)0.05％-0.15％、消泡剂0.05％-0.1％，ph＝5.8-6.0。

技术总结本发明涉及一种霉菌脱氢物的制备方法，用大肠杆菌工程菌产生的脱氢酶对沃氏氧化物进行C1,2位脱氢后再用赭曲霉对沃氏脱氢物连续发酵进行11α羟基化，可有效提高制备霉菌脱氢物的转化率和收率，简化步骤，降低成本。技术研发人员：李秧针,申洁,陆才洋,陈希,王力,曹春宇,李回,贺品受保护的技术使用者：湖南玉新药业有限公司技术研发日：技术公布日：2024/9/12