肝癌的甲基化标志物及其用途和产品的制作方法

本发明属于体外检测,涉及癌症风险预测标志物，具体涉及肝癌的甲基化标志物及其用途。

背景技术：

1、肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，肝癌发病有隐匿性的特点，往往确诊时已经处于疾病的中、晚期，病程短，恶性程度非常高，预后极差，发病率和死亡率比较接近。因此精准的早诊早筛方法对肝癌的诊断、治疗和预后具有重要的意义。

2、目前血清甲胎蛋白（afp）和影像学检查（超声检查、ct检查、核磁共振等）常作为肝癌筛查和诊断的方法。传统超声对各期肝癌的诊断灵敏度约为84%，但对早期肝癌的灵敏度与特异性均较低，分别为63%和45%；对肝硬化患者早期癌变的检出灵敏度仅为47%。血清甲胎蛋白（afp）在有妊娠、慢性或活动性肝病、生殖腺胚胎源性肿瘤以及消化道肿瘤等情况的患者中含量也会升高，只有排除以上情况，甲胎蛋白升高才能提示肝癌。另外，还有约30%的肝癌患者甲胎蛋白是正常的。所以，甲胎蛋白在肝癌诊断中的特异性和敏感性均存在不足。因此迫切需要开发准确性高的早期肝癌风险预测标志物和预测方法。

3、癌症的发生发展伴随着dna甲基化模式的改变，这些变化可能反应在血液的dna中，这为癌症的监测提供了一种非侵入性的手段。基于血液循环游离dna（cfdna）的检测在早期癌症筛查中表现出更高的灵敏度和特异性，并且在癌症的早期风险预测、预后预测、治疗后的动态监测等领域具有广泛的应用前景。对于癌症cfdna甲基化的早期检测，不断改进检测技术，提高检测标志物的灵敏度和特异性，降低检测成本是促进其应用的重要手段。

4、很多研究通过检测外周血中的肿瘤细胞或dna甲基化变化，寻找用于肝癌早期风险预测的标志物。专利cn113234817a和专利cn112501293a都提供了几种有应用开发潜力的肝癌dna甲基化标志物，但是其入组的样本只包含有肝相关疾病的人群，如：肝硬化、肝炎等肝癌高风险人群，没有检测这些标志物在患有其他癌症人群中的甲基化变化，因此可能存在特异性偏低的不足。

技术实现思路

1、本发明的术语和声明：

2、1、如本文所用，冠词"一个"、"一种"和"所述"：除非以其它方式明确地限定到一个(种)对象，否则包括复数的对象。

3、2、如本文所用，数值范围：除非以其他方式明确指出，本文中公开的所有范围或比率将会被理解为包括其中包含的任何和所有的子范围或子比率。例如，声明的1至30的范围或比率应当被认为包含在最小值1和最大值30之间，并且包括断端点在内的任何子范围或子比率、整数、小数或由整数或小数构成的子范围或子比率。

4、3、dna甲基化：dna甲基化（dna methylation）为dna化学修饰的一种形式，能够在不改变dna序列的前提下，改变遗传表现。所谓dna甲基化是指在dna甲基化转移酶的作用下，在基因组cpg二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基基团。大量研究表明，dna甲基化能引起染色质结构、dna构象、dna稳定性及dna与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。

5、4、靶基因dna甲基化测序（target-bs）：对目标基因cpg位点甲基化检测，建立灵活的靶向甲基化测序技术。是针对已有目标基因panel组合，运用甲基化特异性多重pcr引物设计软件，对亚硫酸盐转化后的目标基因多重扩增，建库后进行超高深度甲基化精准检测。

6、5、甲基化特异性pcr（methylation-specific pcr,ms-pcr）是一种特异位点甲基化检测技术。其基本原理是用亚硫酸氢钠处理基因组dna，未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。因此从理论上讲，用不同的引物做pcr，即可检测出这种差异，从而确定基因有无cpg岛甲基化。

7、6、bsp克隆测序法，是目前甲基化检测的金标准。用亚硫酸氢盐处理基因组dna，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后在cpg岛两端设计引物进行pcr，将目的产物纯化后进行ta克隆，每个克隆挑取阳性克隆测序，最后将测得的序列与原始序列比对，统计甲基化位点及数量，并分析甲基化程度。

8、7、癌症缩写：blca，膀胱癌。brca，乳腺癌。coad，结肠癌。gbm，胶质细胞瘤。hnsc，头颈部鳞状细胞癌。kirc，肾透明细胞癌。luad，肺腺癌。lusc，肺鳞状细胞癌。read，直肠腺癌。ucec，子宫内膜癌。

9、本发明针对现有技术存在的问题，提供了用于预测早期肝癌风险的甲基化标志物及其用途。

10、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

11、一方面，本发明提供了一种甲基化位点在肝癌早期风险预测的试剂盒中的应用。

12、具体地，所述试剂盒中包括检测试剂，所述的试剂用于检测样本中一个或多个甲基化位点的甲基化水平，所述甲基化位点包括：位于chr 1:118989773-118989324之间的cpg位点cg25340966；位于chr 1:118989235-118989837之间的cpg位点cg05940231；位于chr 7:158588311-158587715之间的cpg位点cg27392792和位于chr 7:158587844-158588493之间的cpg位点cg22282410。

13、具体地，所述甲基化标志物是从tcga和geo数据库中筛选的，通过对肝癌和对照样本进行测序，验证了4个甲基化标志物作为肝癌早期风险预测标志物的潜力。

14、进一步具体地，所述肝癌样本的选择标准是：经病理学诊断的原发性肝细胞癌、肝内胆管癌和混合型癌，无既往恶性肿瘤史及严重内科疾病，术前未接收任何形式的抗肿瘤治疗；所述对照样本包括肝病、其他癌症和健康样本，对照样本的选择标准是肝病包括药物性肝病和肝硬化失代偿期，其他癌症为肺癌和前列腺癌，健康样本为无异常的体检样本。

15、具体地，所述检测试剂通过检测样本中上述一个或多个位点的甲基化水平完成肝癌早期风险预测。

16、在本发明的某些具体实施例中，所述的甲基化水平为甲基化率（β value）。

17、具体地，所述甲基化水平的检测的方法包括但不限于：bsp、一代测序、二代测序、焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化芯片法、msp甲基化特异性pcr、数字pcr法、三代测序法、全基因组甲基化测序法、dna富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术、hplc法、甲基化特异pcr中的一种或多种。

18、具体地，所述样本包括但不限于：血清、血浆、组织、培养细胞、血液、粪便、唾液、尿液或无细胞dna。

19、在本发明的某些具体实施例中，所述检测样本为血液游离循环dna（cfdna）。

20、可选地，检测所述样本甲基化水平时，所述样本在用于检测前，还包括前处理，所述前处理过程还包括提取样本dna和/或将样本dna未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶的步骤。

21、另一方面，本发明提供了用于检测上述甲基化位点的引物对。

22、具体地，所述引物对包括：检测cg25340966位点甲基化水平的引物：seq id no.1-2；检测cg05940231位点甲基化水平的引物：seq id no.3-4；检测cg27392792位点甲基化水平的引物：seq id no.5-6；检测cg22282410位点甲基化水平的引物：seq id no.7-8。

23、进一步具体地，所述试剂还配备能与引物特异性结合的探针。

24、又一方面，本发明提供了一种肝癌的甲基化标志物。

25、具体地，所述的标志物为单一标志物或组合标志物，所述的标志物包括位于chr1:118989773-118989324之间的cpg位点cg25340966；位于chr 1:118989235-118989837之间的cpg位点cg05940231；位于chr 7:158588311-158587715之间的cpg位点cg27392792和位于chr 7:158587844-158588493之间的cpg位点cg22282410中的任意一个或多个。

26、又一方面，本发明提供了检测甲基化标志物cg25340966，cg05940231，cg27392792和cg22282410中的任意一个或多个甲基化水平的引物。

27、具体地，检测上述甲基化标志物的引物包括以下引物对中的任意一对或多对：

28、（1）检测cg25340966的引物对：seq id no.1-2；

29、（2）检测cg05940231的引物对：seq id no.3-4；

30、（3）检测cg27392792的引物对：seq id no.5-6；

31、（4）检测cg22282410的引物对：seq id no.7-8。

32、又一方面，本发明提供了一种用于预测早期肝癌风险的产品。

33、具体地，所述产品包括检测甲基化标志物cg25340966，cg05940231，cg27392792和cg22282410中的任意一个或多个甲基化水平的引物。

34、具体地，所述检测产品包括seq id no.1-8中的任意一对或多对引物对。