一种建立疏柔毛罗勒的快速遗传转化体系的方法

本发明属于植物遗传转化，涉及一种建立疏柔毛罗勒的快速遗传转化体系的方法。

背景技术：

1、疏柔毛罗勒(学名：ocimum basilicum var.pilosum)，又名荆芥，是唇形目、唇形科、罗勒属一年生草本植物。高20～80厘米，具圆锥形主根及须根。茎直立，多分枝，钝四棱形，小枝具沟槽及短柔毛，幼嫩时红色，渐老变为绿色。叶卵形至卵状长圆形，花冠淡紫色或上唇白色，下唇紫红色，长约6毫米，管长约3毫米，内藏，喉部增大，唇片外面具微柔毛，内面无毛。小坚果卵珠形，长1.5毫米，宽1毫米，黑褐色。花期7～9月，果期9～12月。产中国河北，河南，江苏，浙江，安徽，江西，福建，台湾，广东，广西，贵州，四川，云南，均作为芳香植物栽培，间或有逸为野生的。非洲至亚洲温暖地带也有分布。植株可作为提取芳香油的原料。

2、快速遗传表达体系具有简单便捷、表达量大等优势，可分为电击法、聚乙二醇法、基因枪法、农杆菌渗透法等。其中，农杆菌渗透法作为近年来快速发展的遗传转化方法，具有操作简单、实验周期短、表达效率高及生物安全性高等众多优点，是优良的遗传转化方法。该方法已用于建立番茄(solanum lycopersicum)、青蒿(artemisia caruifolia)、茶树(camellia sinensis)、丹参(salvia miltiorrhiza)、兜兰(paphiopedilum maudiae)等植物的遗传转化体系。

3、目前，疏柔毛罗勒的快速遗传转化体系尚未明确，导致涉及疏柔毛罗勒进一步转录因子及功能基因的遗传转化等研究难以开展，因此，建立一种高效实用的疏柔毛罗勒快速遗传转化体系尤为必要。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种建立疏柔毛罗勒的快速遗传转化体系的方法，为后续疏柔毛罗勒基因功能等研究提供技术支持。

2、本发明采用的技术方案为：

3、一种建立疏柔毛罗勒的快速遗传转化体系的方法，包括：

4、剪切疏柔毛罗勒叶片放入浓度od600＝0.6的含有gus基因的农杆菌菌液中侵染10～30分钟，然后滤纸轻触吸干叶片表面菌液，放入叶片不定芽诱导培养基中，暗培养2～3天，转移至含有100～300μg/ml的特门汀抗生素的叶片不定芽诱导培养基中，培养3～4周后取出不定芽，得到疏柔毛罗勒遗传转化的不定芽叶片苗，所述叶片不定芽诱导培养基为含有0.15mg/l naa、0.2mg/l 6-ba和30g/l蔗糖的ms培养基。

5、优选地，所述疏柔毛罗勒采用以下方法培养：选取均匀饱满的疏柔毛罗勒种子，播种于装有营养土的盆内或疏柔毛罗勒种子萌发生长培养基上，置于25℃、光暗周期16小时光照/8小时黑暗、光照度2 000lx的光照培养箱内培养，出苗后间苗，待其长出4片以上真叶、苗高5.0cm时选取长势较好的疏柔毛罗勒苗移栽定植于大盆，培养至生长期备用。

6、优选地，疏柔毛罗勒种子萌发生长培养基的配方为ms+3mg/l ga3+30g/l蔗糖+8g/l琼脂。

7、优选地，按照以下方法剪切疏柔毛罗勒叶片：拿高压灭菌的剪刀沿着叶子边缘环减去一圈叶缘并减去叶子收尾端一点，露出伤口，剪切时避免操作不当戳破叶子中间组织。

8、优选地，还包括将土培苗叶片按照以下方法消毒：剪下土培苗叶片将其放入自来水中清洗1遍，随后放入高压灭菌水洗1遍，放入泡腾消毒片溶解的消毒水中消毒5～10分钟，最后用高压灭菌水清洗5遍，待切放置。

9、优选地，按照以下方法将叶片放入培养基：将剪切的伤口叶片正面向上放入培养基，背面贴着培养基，随后密封无菌培养。

10、优选地，采用冻融法进行农杆菌转化：

11、①取-80℃保存的农杆菌gv3101感受态于室温融化，待融化至冰水混合态时插入冰中；

12、②取含有gus基因的质粒pbi121 10μl加入到100μl感受态gv3101中；

13、③用手轻轻拨打管底混匀于冰上静置10分钟后放入液氮处理5分钟，37℃水浴5分钟后冰浴5分钟；

14、④加入900μl无抗生素的lb液体培养基，将混合液置于28℃振荡培养2～3小时；

15、⑤将混合液以6 000rpm离心1分钟，收集菌体，留底部菌液轻轻吹打重悬菌块，涂布于50μg/ml kana+和20μg/ml rif的lb固体培养基平板上，28℃倒置培养48小时；

16、⑥从培养完成的平板上挑取单菌落加入10μl的lb液体培养基，吹打混匀；进行pcr鉴定，筛选单克隆阳性菌株备用。

17、优选地，上述方法还包括：

18、①将含有pbi121的单克隆阳性菌株接种于50μg/ml kana+和20μg/ml rif的lb液体培养基，置于28℃，200rpm，摇床中培养一两天，摇至od600＝1.0；

19、②将菌液转移至离心管中，以8 000rpm离心1分钟，弃上清，收集菌体；

20、③用lb液体培养基将农杆菌重悬，调节od600为0.6浓度；

21、④将其放入紫外灭菌20分钟后的超净台中，剪切疏柔毛罗勒叶片放入农杆菌液中侵染15分钟；

22、⑤取出叶片，用滤纸轻触叶片吸取多余的叶片表面菌液后放入不定芽诱导培养基中暗培养2～3天，然后移至含有加入100～300μg/ml的特门汀抗生素的上述叶片不定芽诱导培养基中，培养3～4周后取出不定芽；

23、⑥进行gus染色褪色观察验证，获取疏柔毛罗勒遗传转化不定芽叶苗。

24、本发明的有益效果在于：

25、本发明选取疏柔毛罗勒叶片为材料，以ms+0.1mg/l naa+0.25mg/l 6-ba+30g/l蔗糖+8g/l琼脂为原始诱导培养基，采用正交实验和择优实验对naa、6-ba和蔗糖用量等因素进行分析，结合疏柔毛罗勒叶片不定芽诱导萌发率结果为参考，选出高效培养基诱导疏柔毛罗勒叶片不定芽萌发的培养基配方。随后在此基础上将剪切的叶片进行农杆菌侵染，放入疏柔毛罗勒择优的叶片不定芽诱导培养基上，暗培养后，转入含有特门汀抗生素的叶片不定芽诱导培养基中进行遗传转化。结果表明，当naa浓度为0.15mg/l，6-ba浓度为0.2mg/l和蔗糖为30g/l时，培养2～3周后，疏柔毛罗勒叶片不定芽诱导萌发率最高，含有gus基因的农杆菌gv3101浓度od600＝0.6，暗培养2～3天，特门汀抗生素培养基200μg/ml，转移至+抗生素培养基培养2～3周可进行遗传转化。该遗传体系实用高效，可为快速诱导疏柔毛罗勒叶片不定芽萌发，建立疏柔毛罗勒遗传转化体系等研究提供了支持，在疏柔毛罗勒基因功能的研究方面有良好的应用价值。

技术特征：

1.一种建立疏柔毛罗勒的快速遗传转化体系的方法，包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述疏柔毛罗勒采用以下方法培养：选取均匀饱满的疏柔毛罗勒种子，播种于装有营养土的盆内或疏柔毛罗勒种子萌发生长培养基上，置于25℃、光暗周期16小时光照/8小时黑暗、光照度2 000lx的光照培养箱内培养，出苗后间苗，待其长出4片以上真叶、苗高5.0cm时选取长势较好的疏柔毛罗勒苗移栽定植于大盆，培养至生长期备用。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，疏柔毛罗勒种子萌发生长培养基的配方为ms+3mg/l ga3+30g/l蔗糖+8g/l琼脂。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按照以下方法剪切疏柔毛罗勒叶片：拿高压灭菌的剪刀沿着叶子边缘环减去一圈叶缘并减去叶子收尾端一点，露出伤口，剪切时避免操作不当戳破叶子中间组织。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括将土培苗叶片按照以下方法消毒：剪下土培苗叶片将其放入自来水中清洗1遍，随后放入高压灭菌水洗1遍，放入泡腾消毒片溶解的消毒水中消毒5～10分钟，最后用高压灭菌水清洗5遍，待切放置。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按照以下方法将叶片放入培养基：将剪切的伤口叶片正面向上放入培养基，背面贴着培养基，随后密封无菌培养。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用冻融法进行农杆菌转化：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

技术总结本发明提供了一种建立疏柔毛罗勒的快速遗传转化体系的方法，选取生长期的疏柔毛罗勒叶片为材料，采用正交实验对NAA、6‑BA和蔗糖用量等因素进行分析，结合疏柔毛罗勒叶片不定芽诱导萌发率结果为参考，并设置择优方案实验设计验证，建立了一种高效培养基诱导疏柔毛罗勒叶片不定芽萌发的方法，随即进行农杆菌转化与鉴定，进行疏柔毛罗勒叶片遗传转化。该遗传体系实用高效，可为快速诱导疏柔毛罗勒叶片不定芽萌发，建立疏柔毛罗勒遗传转化体系等研究提供了支持，在疏柔毛罗勒基因功能的研究方面有良好的应用价值。技术研发人员：钮俊,欧琼键,游慧燕,王佳受保护的技术使用者：海南大学技术研发日：技术公布日：2024/9/12