一种快速高效定位多肽内复杂二硫键连接的方法与流程

本发明属于生物医药领域多肽结构表征，涉及一种基于化学裂解结合高分辨质谱进行多肽复杂二硫键的定位方法。

背景技术：

1、二硫键作为一种常见的翻译后修饰广泛存在于天然蛋白质和多肽中，是由氨基酸序列中2个半胱氨酸发生氧化失去2个氢( h)后形成的(-s-s-)共价键。二硫键对稳定蛋白的空间结构和调节其生物活性有着非常重要的作用。精准、快速地定位蛋白质和多肽中二硫键连接方式有助于了解蛋白和多肽的结构和功能，同时也能指导合成工艺。

2、早期对于二硫键的定位方法分为非片段法和片段法，非片段法包括x 射线晶体衍射法和多维核磁共振法，非片段法不会对样品进行破坏且能够提供样品分子水平上的二硫键信息，但是x 射线晶体衍射和核磁共振对于样品纯度要求高且所需样品量巨大，所以很多样品都不能满足检测要求。片段法包括对角线电泳法、酶解法、部分还原测序法等，但是这些方法各存在一些缺点和需要解决的问题，对角线电泳法操作复杂且分辨率低，所需样品量大；酶解法只适用于简单没有临位半胱氨酸的二硫键，同时很多酶都在碱性条件下才发挥作用，而二硫键在碱性条件下极不稳定，容易在实验过程中产生错配；对于部分还原测序法，主要由部分还原结合edman降解法和分步部分还原烷基化结合质谱法，其中部分还原结合edman降解法，费时费力且结果不稳定，而分步部分还原烷基化结合质谱鉴定的方法，由于能用于酸性条件下的烷基化试剂种类有限(仅nem和nmm)，因此很难鉴定含3对以上二硫键的多肽二硫键连接，同时需要很好的控制每步还原的条件才能完成分步还原，多步脱盐洗脱去除还原剂和烷基化试剂会造成样品损失且工作量大。本研究采用衍生裂解结合高分辨质谱(ms/ms)解析多肽复杂二硫键定位的方法可以对包含三对以上且有临位半胱氨酸的二硫键进行快速准确的鉴定。

技术实现思路

1、本发明提供了一种能够高效准确鉴定包含三对及三对以上且含有临位半胱氨酸的复杂交错式二硫键的定位方法，该方法仅需一台质谱仪，前处理简单快速，稳定性好，数据准确易解析，所需样品量少且方法成本低。

2、本方法的技术方案如下：

3、(1)样品部分还原：将待测样品与三( 2-羧乙基)膦( tcep)在酸性条件下于25 ℃恒温静置反应10 min进行部分还原处理，得到样品的部分还原产物；

4、(2)部分还原样品衍生化：将部分还原产物与1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯(cdap)在酸性条件下进行氰基衍生化反应, 使被还原的那对二硫键的半胱氨酸(cys)的s原子衍生化连上1个氰基生成-scn；

5、(3)衍生化裂解：将衍生化的部分还原产物在含有高浓度二硫键还原剂(tcep)的碱性条件下发生衍生化裂解，连有氰基的半胱氨酸(cys)左侧断裂形成新的五元环；

6、(4)用超高效液相色谱串联高分辨质谱对样品化学裂解肽片段进行检测分析，根据发生衍生化裂解的半胱氨酸(cys)的位置定位样品中被还原的二硫键，确定二硫键的连接形式；

7、(5)补充说明：本研究同时会对样品的完整分子量和完全还原分子量进行分析，确认样品内部实际的二硫键连接对数和样品是否形成聚体。

8、本发明中调节溶液至ph=3的酸性试剂可选至三氟乙酸、柠檬酸和甲酸，优选10%的fa进行快速调节。

9、所述的碱性条件均采用1 mol/l nh3·h2o溶液调节。

10、所述的部分还原产物是指样品中部分二硫键被还原打开，部分二硫键未被还原的状态。所述的完全还原指的是样品中所有二硫键全部都被还原的状态。

11、本研究实现的技术难点在于控制部分还原条件和提高衍生裂解的效率。经实验研究发现控制部分还原条件主要要选对还原剂、控制好还原剂的量和反应时间；提高衍生裂解的效率需要控制衍生试剂的浓度和碱性环境，同时需要禁止使用尿素和盐酸胍等抑制质谱信号和污染质谱的试剂。

12、步骤(1)样品部分还原：

13、所述的样品多肽的浓度为0.01~5 μg/μl，优选0.2~2.8 μg/μl。

14、二硫键常见的还原剂有二硫苏糖醇(dtt)，β-巯基乙醇(bme)和三 (2-氯乙基)磷酸酯(tcep)，实践发现dtt和bme会将样品内部所有二硫键还原，作为本发明优选的技术方案，上述步骤1)中部分还原使用的二硫键还原剂优选tcep。

15、所述的还原剂tcep的溶液终浓度为3~15 mm，优选4~10 mm。

16、优选的部分还原条件25℃恒温静置反应10 min。

17、步骤(2)部分还原样品衍生化：

18、所述步骤(2)中的部分还原产物衍生化采用的衍生化试剂为cdap，且cdap的溶液终浓度为40~60 mm。所述的衍生化反应条件为25℃恒温静置反应15 min，反应结束后进行旋干。作为本发明的进一步改进的技术方案，优选的cdap的浓度为50 mm；优选的反应条件为25℃恒温静置反应15 min；常见干燥步骤包括旋干和冻干，本实验优选快速旋干，可以大量节约时间成本；本实验可进行脱盐和不脱盐处理，由于实验过程中用到的tcep和cdap试剂均属于质谱兼容试剂，本实验不进行脱盐处理，可以大大提高裂解肽段的质谱信号和检出率。

19、步骤(3)衍生化裂解：

20、优选的步骤(3)中化学裂解在1 mol/l nh3·h2o溶液中进行，所述的tcep的溶液终浓度为40~50 mm。所述的反应条件为37 ℃恒温静置反应30 min。

21、优选的步骤(4)中所述的液质联用的质谱仪，采用的电喷雾(esi)离子源串联四级杆(q)离子筛选器和静电场轨道肼(orbitrap)质量分析器，对一级母离子和二级碎片离子同时检测的模式。

22、优选的，所述的方法还包括如下步骤：

23、所述的分子量分析包括完整分子量和完全还原分子量：

24、所述的分子量所需样品多肽的水溶液浓度为0.01~1 μg/μl，优选0.2~0.5 μg/μl；对于难容固体样品一般无法进常规的电喷雾(esi)离子源离子化的液质联用仪(lc-ms)检测(esi-qe或esi-q-tof等)，需使用基于基质辅助激光解离技术(maldi-tof)离子化检测分子量。本研究巧妙的采用了0.1% fa进行调节溶解样品，仅使用一台仪器完成了二硫键的鉴定和分子量的同步分析。

25、优选的完整分子量采用0.1% fa进行调节溶解后直接上液质联用仪检测。

26、优选的完全还原分子量采用0.5 m dtt溶液还原，优选的dtt终浓度为10~15 mm，优选的完全还原反应条件为37 ℃水浴30 min。

27、本发明的一种快速高效定位多肽内复杂二硫键连接的方法，仅利用一台质谱仪器完成了多肽内部含有三对及三对以上且含有临位半胱氨酸的复杂交错式二硫键鉴定和分子量分析，方法稳定，前处理操作简单，数据准确异分析，克服了三对以上且含有临位半胱氨酸的复杂交错式二硫键的鉴定难点问题，能够助力于蛋白和多肽的结构研究。