穿过血脑屏障的溶瘤病毒制剂的制备和应用

本发明涉及纳米药物领域，涉及一种穿过血脑屏障的溶瘤病毒制剂的制备和应用。

背景技术：

1、溶瘤病毒疗法(oncolytic virotherapy)是肿瘤免疫疗法的一个重要分支。溶瘤病毒疗法使用具有复制能力的病毒，选择性地复制和杀死癌细胞。溶瘤病毒(ovs)通过不同的机制导致癌细胞死亡，包括细胞凋亡、细胞焦亡和坏死性凋亡。直接溶瘤会释放广泛的肿瘤相关抗原(taa)/新抗原或危险相关分子模式和病毒病原体相关分子模式，从而引发肿瘤微环境(tme)中的炎症免疫反应。高度免疫抑制性tme是恶性肿瘤的特征，这是由于t细胞对肿瘤特异性抗原的耐受性的缺失和发展，以及t细胞在骨髓中的隔离而引起的全身免疫抑制。ovs可以增加免疫细胞浸润并引发tme内的炎症，这对于打破免疫耐受至关重要，并可以提高肿瘤对免疫检查点抑制剂的反应性。在恶性肿瘤的临床前和临床水平上，越来越多的ov正在被广泛测试，其中一些有力的ov候选者是腺病毒(dnx-2401)、脊髓灰质炎病毒(pvs-ripo)和逆转录病毒载体(toca 511)等，部分产品已在美国、中国等地上市。

2、溶瘤病毒目前可用于治疗晚期的黑色素瘤、肺癌、胃肠道肿瘤等，其多用于对二线甚至三线治疗方案耐药的患者。这些患者的肿瘤往往伴有外周器官侵犯、远端转移、治疗抵抗等难治性特征。在临床实践中，这些患者常伴有脑转移，其中肺癌、黑色素和胃癌多于早期向颅内转移。脑部肿瘤病程短，起病后病情呈进行性加重，如发生肿瘤出血坏死病情呈突然加重，也可呈卒中样发病。目前针对脑部肿瘤的治疗手段有限，主要原因是存在血脑屏障(bbb)，bbb是中枢神经系统和外周血液循环之间的复杂保护屏障。它是由脑毛细血管内皮细胞(bcecs)、星形胶质细胞终足、外周细胞和血管基底膜组成的紧密结构。与其他组织相比，血脑屏障几乎没有细胞间隙，极大地限制了溶质或药物的细胞外扩散。一般来说，98％以上的小分子药物和几乎所有的大分子药物都不能穿透血脑屏障。脑靶向药物输送系统旨在解决这些问题，它需要穿过血脑屏障并选择性地提高脑组织中的药物浓度。到目前为止，大脑中的药物输送系统主要分为三种类型：(1)吸收介导的转胞吞作用(amt)；(2)载体介导的运输(cmt)系统；(3)受体介导的胞吞作用(rmt)。由于bcec过表达许多不同的受体，rmt已成为脑靶向药物递送最常用的策略之一。正如预期的那样，rmt证明了化学治疗药物的bbb渗透性增强并改善了脑瘤的治疗效果，rmt作为一种选择性主动转运方法，已广泛应用于脑靶向研究。

3、烟碱型乙酰胆碱受体(nachr)是一种离子门控通道受体，主要在神经元细胞中表达。此外，还有许多关于脑内皮细胞和其他肿瘤细胞中nachr表达的研究。因此，靶向nachr可以推动药物穿过bbb，并基于rmt效应实现肿瘤特异性积累。狂犬病毒糖蛋白肽(rvg)是一种表达于狂犬病毒表面的具有29个氨基酸序列的糖蛋白，能够与神经元细胞中表达的nachr特异性结合，使病毒进入。特别的是，nachr的α7亚基在包括毛细血管内皮细胞在内的脑中广泛表达。尽管脑内皮细胞形成的紧密连接阻止了许多药物通过bbb，但研究表明，rvg29肽可以使治疗药物穿过bbb，并通过与nachr结合迅速到达脑肿瘤部位。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种穿过血脑屏障的溶瘤病毒制剂，用于治疗脑部肿瘤的研究。首先，将nhs-peg-mal与重组人gm-csf溶瘤ii型单纯疱疹病毒(oh2)相结合(oh2-peg)，提高药物的水溶性，同时避免了体内中和抗体以及巨噬细胞对溶瘤病毒的中和和吞噬，延长体内循环时间。再通过nhs-peg-mal上的mal基团与能够帮助治疗药物穿过血脑屏障的rvg29-cys上的cys基团相结合，最终构建oh2-peg-rvg纳米系统。本发明所构建的纳米系统为ovs治疗脑部肿瘤提供了一个有前景的平台。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明提供一种穿过血脑屏障的溶瘤病毒制剂，为经过具有穿过血脑屏障功能的多肽修饰的溶瘤病毒。

4、所述的溶瘤病毒优选为敲除野生型病毒基因组中的神经毒性基因和免疫抑制基因，插入增强免疫的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hgm-csf)的基因工程化溶瘤病毒oh2。

5、所述的提高药物的水溶性，同时避免体内中和抗体以及巨噬细胞对溶瘤病毒的中和和吞噬，延长体内循环时间的活性基团为nhs-peg-mal。

6、所述的具有穿过血脑屏障功能的多肽为rvg29-cys。

7、本发明的穿过血脑屏障的溶瘤病毒的制备方法，包括：

8、将ovs与具有穿过血脑屏障功能的多肽在4℃下孵育，然后通过滤膜和超滤管去除没有反应的活性基团，在超离管内再次加入pbs重悬后，得到能够穿过血脑屏障的溶瘤病毒。

9、优选地，穿过血脑屏障的溶瘤病毒为oh2-peg-rvg。该oh2上存在丰富的氨基，可以和nhs酯结合；peg上存在丰富的mal基团，可以和cys基团结合。

10、优选地，穿过血脑屏障的溶瘤病毒的制备方法为：将oh2分别与不同浓度的nhs-peg-mal在常温下(20-25℃)孵育，然后通过滤膜和超滤管去除没有反应的活性基团，采用碘化钡对peg染色，确定最适反应制剂量(peg修饰密度为45％)。其中，按溶质个数与病毒粒子数比，oh2：nhs-peg-mal(1.6×102/vp)。

11、优选地，具有提高药物的水溶性，同时避免体内中和抗体以及巨噬细胞对溶瘤病毒的中和和吞噬，延长体内循环时间的活性基团中，peg的分子量为1-5kda，peg分子量超过5kda后减弱溶瘤病毒的感染活性。

12、优选地，在超离管中，采用的低速离心转数为5000-10000rpm，离心5-10min；

13、优选地，所用滤膜孔径为0.45μm和0.22μm；

14、优选地，所用超滤管的截留分子量为50-100kda；

15、优选为，所述的穿过血脑屏障的溶瘤病毒需要在放入-80℃保存备用。

16、本发明制备的oh2-peg-rvg的粒径为193-199nm，分散指数pdi为0.08-0.1，粒径较均一(pdi＜0.3)，该范围内的纳米颗粒稳定，具有穿过血脑屏障作用。

17、在具有提高药物的水溶性，同时避免体内中和抗体以及巨噬细胞对溶瘤病毒的中和和吞噬，延长体内循环时间功能的活性基团在进行孵育之前，需要进行水化反应，水化反应的具体工艺为：

18、将具有提高药物的水溶性，同时避免体内中和抗体以及巨噬细胞对溶瘤病毒的中和和吞噬，延长体内循环时间功能的活性基团nhs-peg-mal粉末与pbs以1-10mg/ml的比例混合均匀，进行水化反应，得到溶液，所述的水化反应在室温下进行，水化反应时间至少30min，得到具有抗原捕获功能的活性基团的水溶液，并在4℃下保存。

19、在具有穿过血脑屏障功能的多肽在进行孵育之前，需要进行水化反应，水化反应的具体工艺为：

20、将具有穿过血脑屏障功能的多肽rvg29-cys粉末与pbs以1-10mg/ml的比例混合均匀，进行水化反应，得到溶液，所述的水化反应在室温下进行，水化反应时间至少30min，得到具有穿过血脑屏障功能的多肽的水溶液，并在-20℃下保存。

21、本发明的一种穿过血脑屏障治疗脑部肿瘤的溶瘤病毒制剂的应用，为在制备治疗脑部肿瘤药物中的应用。

22、所述的应用为：制备oh2-peg-rvg29制剂后，采用静脉注射的方式进行用药。

23、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

24、溶瘤病毒是新型的免疫疗法，目前可用于治疗晚期的黑色素瘤、肺癌、胃肠道肿瘤等。但针对脑部肿瘤的治疗手段有限，主要原因是存在血脑屏障。一般来说，98％以上的小分子药物和几乎所有的大分子药物都不能穿透血脑屏障。脑靶向药物输送系统旨在解决这些问题，它需要穿过血脑屏障并选择性地提高脑组织中的药物浓度。将peg连接到溶瘤病毒，可以显著提高药物的水溶性，同时避免体内中和抗体以及巨噬细胞对溶瘤病毒的中和和吞噬，延长体内循环时间。而rvg29通过与nachr的结合将溶瘤病毒制剂迅速运送到脑肿瘤部位。

25、本发明旨在围绕已上市溶瘤病毒难以突破血脑屏障的困境，提出了“溶瘤病毒-多肽纳米系统”的概念，用于治疗脑部肿瘤的研究。在帮助治疗药物穿过血脑屏障治疗脑部肿瘤的同时，提高药物的水溶性，并避免了体内中和抗体以及巨噬细胞对ad的中和和吞噬，延长体内循环时间。本发明所构建的纳米系统为ovs治疗实体肿瘤脑转移提供了一个有前景的平台。