一种阳离子聚合物及其制备方法和应用、mRNA递送系统与流程

本发明涉及一种医药生物，特别是涉及一种阳离子聚合物及其制备方法和应用、mrna递送系统。

背景技术：

1、m r n a(信使核糖核酸)是由d n a(脱氧核糖核酸)双链中的一条链为模板(template)，在rna聚合酶(rna polymerase)的催化作用下，以4种三磷酸核糖核苷(a、u、g、c)为底物，通过磷酸二酯键聚合而成的一类单链核糖核酸。mrna能够携带并传递细胞核内dna所存储的遗传信息，在遗传信息向功能性蛋白的转换过程中发挥着关键作用。在细胞质中，未成熟的mrna通过加帽，加尾，以及内含子剪切等步骤完成加工修饰变成成熟的mrna，成熟的mrna能够精确指导细胞质中蛋白质的合成过程。相对来说，由于mrna比dna的分子量小得多，易于转染，并且不会有整合到宿主dna而引发插入突变的致癌风险。因此，以mrna为预防性和治疗性药物，在多种疾病的防治方面有着巨大的优势和潜力。

2、mrna核酸类药物是利用分子生物学的方法将目的功能基因或者目的基因的功能亚单位通过信使核糖核酸的形式导入患者体内，经靶向性胞内递送，晚期内含体逃逸，细胞内翻译及翻译后加工修饰，表达出具有特定功能的蛋白质，用以预防(功能性蛋白或者亚单位激活宿主免疫系统产生相应体液免疫或细胞免疫反应)或治疗疾病(表达出的蛋白或者亚单位具有治疗疾病的功能或调节其他基因表达的作用)的一种防治策略。与其他方法相比，其优势在于它可以直接在分子水平上激活机体产生针对特定病原体的功能性抗体或细胞免疫反应，或者有针对性地修复致病基因或纠正异常基因的表达，从而达到多种疾病预防和治疗的作用。mrna核酸类药物可以达到传统药物无法替代的效果，例如单克隆抗体药物只能作用于细胞表面，而mrna核酸类药物不仅可以针对细胞膜外蛋白发挥作用，也可以对细胞内蛋白发挥作用，甚至可以在细胞核内发挥作用，并具有精确的靶向性。在人类面临的7000多种疾病中，约1/3的疾病是由于功能性基因的表达出现了问题(缺失、降低或过表达)，如血友病(hemophilia)、杜氏肌营养不良(dmd)、囊性纤维化(cysticfibrosis)和严重的免疫缺陷综合征(scid)等，在临床上几乎是无药可治，而mrna核酸类药物对这种单基因疾病非常有优势。在个性化医疗以及精准医疗普及的时代背景下。理论上，由患者基因差异或基因表达异常引起的疾病，都可利用mrna核酸药物对其进行精准有效的治疗。

3、mrna核酸类药物虽然在调控基因表达及恶性疾病的预防和治疗中有巨大的优势和潜力。但此类药物的研发、制备以及后续系统给药中均面临着诸多困难。首先，mrna是以单链的形式存在，导致mrna在体外及生理条件下极不稳定，不仅易被空气中或血液中的rna核酸酶(rnaase)所降解，还易被肝脏、脾脏等组织器官中单核巨噬细胞清除；其次，由于mrna带负电性，使其难以穿过细胞膜进入到细胞内部；再次，mrna难以从内涵体逃逸并进入细胞质中发挥作用。此外，mrna的尿嘧啶核糖核苷(u)易产生免疫原性，在某些情况下，免疫原性的产生有可能会增加mrna药物潜在的毒副作用。最后，易产生脱靶效应也是mrna核酸类药物在制备以及给药过程中面临的重要挑战。因此，mrna核酸类药物胞内递送系统的开发，是其能够大规模临床应用的关键所在。

4、为了更安全有效地发挥rna的治疗能力，科学家使用脂质纳米颗粒(lnp)来封装和传递rna到机体特定部位。这种rna递送策略在递送双链小干扰rna(sirnas，21到23个核苷酸长度)方面展现出了巨大的应用价值。比如类脂质c12-200已被广泛用于制作sirna-lnp制剂，用于体内各种治疗应用，以抑制蛋白表达。人工合成的可电离脂质材料(syntheticionizable lipids)和类脂质材料(lipid-like materials)出现后，不仅大大降低了lnp的体内毒性，还使得体内递送大分子量rna(比如mrna)成为可能。这些含胺的可电离脂质或类脂质分子带正电荷，通过静电吸引的方式，可以高效的与带负电荷的mrna结合并自组装形成lnp。lnp能够提高rna的血液循环时间，并提高细胞的摄取率；在细胞内rna通过内体逃逸途径，释放到细胞质中，得以表达出特定的蛋白，起到一定的治疗作用。

5、lnp的原料成分主要有以下4种：1)可电离脂质或类脂质分子(如dlin-kc2-dma、dlin-mc3-dma、l319、sm102)。这是实现体内递送mrna的核心成分。2)磷脂分子(辅助磷脂)，是一种磷脂，它为lnp双分子层提供结构，也可能有助于核内体逃逸，例如dspc二硬脂酰磷脂酰胆碱；3)胆固醇，增强lnp稳定性，促进膜融合；4)聚乙二醇脂质，例如dmg-peg2000，它可以控制并减少lnp的粒径，并“保护”lnp不受免疫细胞非特异性内吞作用的影响。

6、在体内，lnp的原料和组分变化会对mrna-lnp制剂的物理化学稳定性和mrna作用效力产生深远影响。现有的lnp组分方案无法充分的发挥mrna-lnp制剂的效力，所以，目前亟需开发mrna-lnp递送系统的辅助剂，以提高lnp的递送效率，以及亟需开发新的mrna递送系统。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供一种阳离子聚合物及其制备方法和应用、mrna递送系统，主要目的在于提供一种阳离子聚合物，其中，该阳离子聚合物不仅能制备成纳米胶束作为mrna-lnp递送系统的辅助剂，提高lnp的递送效率；而且该阳离子聚合物与mrna制成纳米胶束后，还能单独递送mrna。

2、为达到上述目的，本发明主要提供如下技术方案：

3、一方面，本发明实施例提供一种阳离子聚合物，其中，所述阳离子聚合物为{p(pegma4-5)a-phmab}x-{pbmac-pdmaemad-ppaae}y，结构如式(i)所示：

4、

5、其中，在式(i)中：

6、a为pegma4-5在{p(pegma4-5)a-phmab}中的分子量占比百分比；

7、b为phma在{p(pegma4-5)a-phmab}中的分子量占比百分比；

8、c为pbma在{pbmac-pdmaemad-ppaae}中的的分子量占比百分比；

9、d为pdmaema在{pbmac-pdmaemad-ppaae}部分的分子量占比百分比；

10、e为ppaa在{pbmac-pdmaemad-ppaae}部分的分子量占比百分比；

11、x为{p(pegma4-5)a-phmab}的分子量；

12、y为{pbmac-pdmaemad-ppaae}的分子量。

13、优选的，所述阳离子聚合物为{p(pegma4-5)a-phmab}x-{pbmac-pdmaemad-ppaae}y-cpa，结构如式(ii)所示：

14、

15、优选的，在所述式(ii)中：a为85.1-85.8％，b为14.2-14.9％，c为50-54％，x为5.4-7.1kda，d为30-37％，e为12-16％，y为57-79.9kda。优选的，a为85.7-85.8％，b为14.2-14.3％，c为50-54％，x为5.4-7.1kda，d为30-37％，e为12-16％，y为57-79.9kda。

16、优选的，所述阳离子聚合物为{p(pegma4-5)a-phmab}x-{pbmac-pdmaemad-ppaae}y-ect，结构如式(iii)所示：

17、

18、优选的，在所述式(iii)中：a为85.6-86.3％，b为13.7-14.4％，c为52-67％，x为5.5-6.2kda，d为30-35％，e为3-13％，y为13.6-16.8kda。

19、另一方面，本发明实施例还提供所述阳离子聚合物{p(pegma4-5)a-phmab}x-{pbmac-pdmaemad-ppaae}y-cpa的制备方法，其中，制备方程式如下：

20、

21、另一方面，本发明实施例还提供阳离子聚合物{p(pegma4-5)a-phmab}x-{pbmac-pdmaemad-ppaae}y-ect的制备方法，其中，制备方程式如下：

22、

23、

24、再一方面，本发明实施例提供一种阳离子聚合物纳米胶束，其中，所述阳离子聚合物纳米胶束是由上述的阳离子聚合物制备而成。

25、优选的，所述阳离子聚合物纳米胶束的制备方法，包括如下步骤：

26、将阳离子聚合物溶解于溶剂中，得到聚合物溶液；

27、对所述聚合物溶液进行过滤，得到过滤后的溶液；

28、对所述过滤后的溶液进行除溶剂处理，得到阳离子聚合物纳米胶束；

29、优选的，所述溶剂选用甲醇、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺dmf、二甲基亚砜dmso中的任一种；

30、优选的，当所述溶剂选用甲醇、乙醇、丙酮中的任一种时，所述除溶剂处理的方法选用蒸发法或超滤法；

31、优选的，当所述溶剂选用二甲基甲酰胺dmf或二甲基亚砜dmso时，所述除溶剂处理的方法选用超滤法。

32、再一方面，本发明实施例提供的阳离子聚合物纳米胶束在作为或制备mrna-lnp递送系统的辅助剂中的应用，以提高lnp在注射部位的递送效率。优选的，注射部位为肌肉注射部位。

33、再一方面，本发明实施例提供一种mrna-lnp递送系统的辅助剂，其中，所述mrna-lnp递送系统的辅助剂包括上述的阳离子聚合物纳米胶束。

34、优选的，所述mrna-lnp递送系统的辅助剂在使用时：所述辅助剂和mrna-lnp递送系统需在不同的注射部位进行注射。优选的，注射部位为肌肉注射部位。

35、优选的，所述mrna-lnp递送系统中的lnp组合物包括可电离阳离子脂质、胆固醇、聚乙二醇脂质；或所述mrna-lnp递送系统中的lnp组合物包括可电离阳离子脂质、胆固醇、聚乙二醇脂质、辅助磷脂。

36、再一方面，上述的阳离子聚合物在制备mrna递送系统中的应用。

37、优选的，所述阳离子聚合物能包裹mrna形成纳米胶束，进行mrna递送；优选的，将阳离子聚合物溶解在溶剂中形成阳离子聚合物溶液；将所述阳离子聚合物溶液与mrna溶液搅拌混合后，除去溶剂后，得到mrna递送系统；优选的，所述溶剂选用甲醇、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺dmf、二甲基亚砜dmso中的任一种；优选的，除去溶剂的方法选用透析法。

38、与现有技术相比，本发明的一种阳离子聚合物及其制备方法和应用、mrna递送系统至少具有下列有益效果：

39、本发明实施例开发一种阳离子聚合物，其结构如式(i)、式(ii)、式(iii)所示。其中，该阳离子聚合物不仅能制备成纳米胶束，作为mrna-lnp递送系统的辅助剂，提高lnp的递送效率。而且该阳离子聚合物与mrna制成纳米胶束后，还能单独递送mrna。

40、上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。