微量新鲜样本六组学连续提取方法与流程

本发明属于微量样本多组学连续提取方法，具体而言，涉及一种微量新鲜样本六组学连续提取方法。

背景技术：

1、疾病的发生与发展是高度复杂的过程，通常不以某个特定因素为中心，而是经由多类生物分子相互作用和调控共同导致[1]。单一组学通常只关注生命体系中特定分子的功能和变化特征，只能表征生命活动的某一环节，如基因组学只能描绘基因序列而无法说明这些基因的表达水平[2]。单组学的有限信息无法揭示不同分子之间存在的相互作用、信号传导和调控网络，使得对生物系统的整体理解存在缺失[3]。为了更好地挖掘疾病机制，往往需要采用多组学多角度对复杂的生物系统进行详细表征，从而全面了解生物体中多类分子状态及其相互关系的变化[4]。多组学的信息整合以及数据交叉互补联合分析，可以获得更加全面和准确的疾病图景，且不同组学层面的相互补充和印证可以更为系统性地表征疾病的发生发展过程，从而挖掘疾病的发生机制，寻找潜在的诊断标志物和治疗靶点，为疾病的预防、诊断和治疗提供更有效的方法[5]。

2、多组学联合表征的前提是得到同一样本的多个不同组学成分[6]。许多已发表的疾病相关多组学研究中，研究者通常将同一份样本分割成若干份，再从分割后的不同份样本中分别提取所需组分[7-10]，这忽略了组织内异质性[11]，给后续的多组学数据联合分析引入了系统误差[12]。bhat ar等人[13]通过比较从同一份咽喉肿瘤组织连续切片中连续提取得到蛋白质组和转录组(记为方法1)，以及从两份组织切片中分别提取蛋白质组和转录组(记为方法2)，发现方法1得到的差异表达蛋白质和差异表达转录本的重叠数量是方法2的两倍，且方法1中高达95％的重叠差异表达物质调控趋势一致，结果清晰地表明了组织内异质性对转录本和蛋白质水平差异表达谱的影响。此外，临床研究中获得的大部分组织活检样本，其本身的生物量便很少，往往只够单一组学的提取，难以均分多次提取以获取多种组学成分[14-16]。综上所述，从同一样本中顺序分离多种组分是实现系统性多组学研究的基本先决条件，而在此基础上通过减少提取所需的样本生物量以便在生物量有限的临床样本中获得多组学成分可以最大限度地利用珍贵的临床样本资源，因此基于微量组织的多组学连续提取方法亟待开发。

3、目前已有许多多组学连续提取方法发表。burnum等人[17]开发了从同一份病原体样本中连续提取脂质组、代谢组、蛋白组的方法。然而，该方法只能进行脂质组、代谢组、蛋白组三种组学成分的连续提取，不包括基因组和转录组。coombs等人[18]使用硫氰酸胍配合氯化铯梯度离心，从肿瘤样本中成功分离dna、rna和蛋白质。然而，该方法只能进行基因组、转录组、蛋白组三种组学成分的连续提取，不包括代谢组和脂质组，而且进行氯化铯梯度离心需要分析超离心机，设备不常见且昂贵。leuthold等人[19]采用改良的rna提取方法，成功同时从单个肾组织样本中提取了rna和代谢物。然而，该方法只能进行代谢组和转录组的提取，不包括脂质组、基因组、蛋白组。woodward等人[20]成功从脑癌细胞系中完成了代谢物和rna的双提取。然而，该方法只能进行代谢组和转录组的提取，不包括脂质组、基因组、蛋白组。hasegawa等人[24]开发了从单个样本中连续提取脂质、代谢物、dna、rna、小rna和蛋白质的方法。然而，该方法需要与qiagen的allprep dna/rna/protein mini试剂盒和rneasyminelute cleanup试剂盒联用才能获得dna、rna、小rna和蛋白质，成本高昂；而且提取所需的样本起始量高，需要30mg；此外，代谢物鉴定数量少，仅鉴定到43种。市面上也有许多基于固相离心纯化柱的商业化试剂盒可以进行多组学提取，如诺维赞、norgen、omega等均推出了支持rna和dna共提取的试剂盒，qiagen的allprep试剂盒和ge healthcare的tripleprep试剂盒支持rna、dna和蛋白质的三重提取[21-22]。此外，市售的trizol也提供了rna、dna和蛋白质的三重提取方案[23]。但它们都存在价格高昂的缺点。

4、综上，虽然现有方法能够实现多组分分离，但目前还没有一种方法可以从单份微量(10mg)组织样本中连续提取脂质组、代谢组、蛋白组、磷酸化蛋白组、转录组、基因组，并且使获得的六个组分均具备足够高的生物质量用于后续组学分析。

技术实现思路

1、本发明旨在建立适用于样本的脂质组、代谢组、蛋白组、磷酸化蛋白组、转录组和基因组共提取方法，实现从单份微量(例如，对于组织样本，低至10mg，甚至低至5mg；对于细胞样本，低至1×107个细胞，甚至低至1×106个细胞；对于体液样本低至1ml体液(如血液)，甚至低至100μl体液(如血液))样本中获得足够质量的六种组分用于后续的多组学分析。本发明的方法将以经典的基因组、转录组、蛋白组、代谢组和脂质组单提取方法得到的各组分为对照，从得率、完整度、定性、定量等多方面进行评估。该方法的建立将为系统生物学研究提供更全面的数据基础，推动对生物体复杂性的理解和疾病机制的解析。

2、因此，本发明提供了一种微量样本六组学连续提取方法，包括以下步骤；

3、s1，样本准备；获取样本；

4、s2，脂质组和代谢组提取：对s1中得到的样本中加入rna保护试剂(例如，rnalater)，并同时提取脂质组和代谢组，提取完成后离心，得到主要含有脂质组的部分，主要含有代谢组的部分，主要含有蛋白组、磷酸化蛋白组、转录组和基因组的部分；

5、s3，蛋白组提取：将s2中得到的主要含有蛋白组、磷酸化蛋白组、转录组和基因组的部分加入rna保护试剂(例如，rnalater)，混匀，再加入用于蛋白组提取的裂解液，混匀，超声处理(特别是，在0-4℃下超声处理)，然后离心得到上清和沉淀，上清用于蛋白质组提取、磷酸化蛋白组提取和转录组提取，沉淀用于基因组提取；取部分上清进行蛋白质组提取，得到蛋白质组；

6、s4，磷酸化蛋白组提取；取部分s3中得到的蛋白组进行磷酸化蛋白组富集，得到磷酸化蛋白组；

7、s5，转录组提取；取部分s3中得到的上清进行转录组提取，得到转录组；

8、s6，基因组提取：取s3中得到的沉淀进行基因组提取，得到基因组。

9、本方法s1中，样本是指生物体的组织样本、体液样本或细胞样本，包括但不限于，组织粉末、组织匀浆、细胞、血液(全血、血清、血浆)、唾液、尿液、脑脊液，等等。

10、在一些实施方式中，所述生物体可以是动物，包括但不限于哺乳动物，例如，人，鼠，狗，猫，猪，羊，牛，马，骆驼，等等。

11、在一些实施方式中，所述组织样本可以是组织粉末或组织匀浆，例如，肝脏组织粉末或肝脏组织匀浆。所述组织粉末或组织匀浆可以使用例如研磨的方法，可以使用电动研磨杵、磁珠法研磨、低温组织研磨仪、covaris的微量样本粉碎仪(cryoprep automated drypulverizer)等得到；若样本量足够多，则使用液氮环境研钵手动研磨也可。即组织研磨步骤只需要保证低温、样本损失少，任何方法都可。在一些实施方式中，所述组织粉末或组织匀浆可以通过将新鲜组织样本在液氮环境下研磨成粉末而得到。

12、在一些实施方式中，s1包括将新鲜样本(特别是，组织样本)在液氮环境下研磨成粉末的步骤。

13、在另一些实施方式中，s1包括向新鲜样本(特别是，组织样本)中加入rna保护试剂并用液氮速冻的步骤。在这种情况下，可以在后续s2的脂质组和代谢组提取步骤中直接加入相应提取试剂并进行匀浆(优选地，使用天根研磨杵进行研磨)，再进行后续步骤。在一些实施方式中，用于制备所述样本的组织、体液或细胞可以是新鲜的组织、体液或细胞，也可是新鲜冻存组织、体液或细胞(例如，将新鲜组织以液氮速冻并转移至-80℃冰箱冻存)。

14、在一些实施方式中，任选地，可以向样本中加入rna保护试剂以抑制rnase对rna的降解，保护rna，延长样本保存时间。rna保护试剂的实例包括但不限于，thermo的“rnalater稳定液”，qiagen的“rnaprotect tissue reagent”等。此外，作为rna保护试剂，还可以使用同时具有保护rna和dna的功能的产品，例如，qiagen的“allprotect”等。此外，作为rna保护试剂，还可以使用其他的rna酶抑制剂，如thermo的“ribolock rnase抑制剂”，碧云天的“rnase inhibitor”等。

15、在一些实施方式中，所述样本用量可以对于组织样本，低至10mg，甚至低至5mg；对于细胞样本，低至1×107个细胞，甚至低至1×106个细胞；对于体液样本低至1ml体液(如血液)，甚至低至100μl体液(如血液)。

16、在一些实施方式中，本方法s2中的操作均在0-4℃的环境下进行。

17、本方法s2中，在一些实施方式中，可以使用甲基叔丁基醚提取法(matyash v,liebisch g,kurzchalia tv,shevchenko a,schwudke d.lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics.j lipid res.2008may；49(5):1137-46.doi:10.1194/jlr.d700041-jlr200.epub 2008feb 16.pmid:18281723；pmcid:pmc2311442.)或其改进方法(例如：sostare j,di guida r,kirwan j,chalal k,palmere,dunn wb,viant mr.comparison of modified matyash method to conventionalsolvent systems for polar metabolite and lipid extractions.anal chimacta.2018dec11；1037:301-315.doi:10.1016/j.aca.2018.03.019.epub 2018apr5.erratumin:anal chim acta.2019dec 24；1091:169.pmid:30292307.)进行代谢组和脂质组提取。本方法s2中，当使用甲基叔丁基醚法提取代谢和脂质组时，对s1中得到的样本中加入rna保护试剂(例如，rnalater)，并同时提取代谢组和脂质组，提取完成后离心，溶液分层并得到沉淀，溶液上层为主要含有脂质组的部分，溶液下层为主要含有代谢组的部分，沉淀为主要含有蛋白组、磷酸化蛋白组、转录组和基因组的部分。

18、或者，本方法s2中，在一些实施方式中，也可以使用，与甲基叔丁基醚提取法同为双相提取法的氯仿提取法(folch j,lees m,sloane stanley gh.a simple method forthe isolation and purification of total lipides from animal tissues.j biolchem.1957may；226(1):497-509.pmid:13428781；bligh eg,dyer wj.a rapid method oftotal lipid extraction and purification.can j biochem physiol.1959aug；37(8):911-7.doi:10.1139/o59-099.pmid:13671378.)等；或者单相提取法，如用甲醇、乙腈(乙腈)、丙酮、正丁醇等。本方法s2中，当使用氯仿/甲醇/水提取脂质组和代谢组时，对s1中得到的样本中加入rna保护试剂(例如，rnalater)，并同时提取代谢组和脂质组，提取完成后离心，溶液分层，溶液上层为主要含有代谢组的部分，溶液下层为主要含有脂质组的部分，溶液中间层为主要含有蛋白组、磷酸化蛋白组、转录组和基因组的部分。

19、或者，本方法s2中，当使用乙腈/甲醇/水提取脂质组和代谢组时，对s1中得到的样本中加入rna保护试剂(例如，rnalater)，并同时提取代谢组和脂质组，提取完成后离心，得到上清和沉淀，上清为主要含有代谢组和脂质组的部分，既可用于脂质组分析又可以用于代谢组分析，沉淀为主要含有蛋白组、磷酸化蛋白组、转录组和基因组的部分，可以用于蛋白组、磷酸化蛋白组、转录组和基因组的分析。

20、在一些实施方式中，本方法s2包括以下步骤：对s1中得到的样本中加入rna保护试剂(例如，rnalater)，并通过甲醇、甲基叔丁醚和水对样本进行提取，提取完成后离心，溶液分层并得到沉淀，溶液上层为主要含有脂质组的部分，溶液下层为主要含有代谢组的部分，沉淀为主要含有蛋白组、磷酸化蛋白组、转录组和基因组的部分。其中甲醇、甲基叔丁醚和水的比例没有特别限制，只要其能够实现脂质组和代谢组提取即可。在进一步的一些实施方式中，甲基叔丁基醚/甲醇/水的体积比可以是20/6/7，或者5/1.5/1.25，或者5/1.5/1.45，等等。

21、在一些实施方式中，本方法s2包括以下步骤：

22、s2-1，取s1中得到的样本，加入rna保护试剂(例如，rnalater)，并混匀，混匀后瞬离；

23、s2-2，向s2-1得到的混合物中加入甲醇和depc水并混匀，混匀后瞬离，或者当s1中得到的样本为块状样本时，向s2-1得到的混合物中加入甲醇和depc水并进行研磨；

24、s2-3，向s2-2得到的混合物中加入甲基叔丁基醚，并混匀；

25、s2-4，将s2-3得到的混合物进行孵育(例如，使用水平振荡仪振荡孵育)；

26、s2-5，对s2-4孵育的混合物进行瞬离，再加入depc水，并混匀；

27、s2-6，将s2-5得到的混合物静置孵育分相；

28、s2-7，将s2-6孵育后的混合物离心，溶液分层并得到沉淀；

29、s2-8，吸取溶液上相用于脂质组分析，吸取溶液下相用于代谢组分析，沉淀用于后续提取蛋白组、磷酸化蛋白组、转录组和基因组。

30、本发明中，depc水是用depc(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的超纯水(一级水)，无色液体。经检测不含杂质rna、dna和蛋白质。

31、在一些实施方式中，s2-1中，本方法所述的样本较为微量，例如对于组织样本，低至10mg，甚至低至5mg；对于细胞样本，低至1×107个细胞，甚至低至1×106个细胞；对于体液样本低至1ml体液(如血液)，甚至低至100μl体液(如血液)。

32、本发明在提取完脂质组和代谢组后，没有使用沉淀首先进行rna的提取，而是先进行蛋白组的提取，这样能最大程度的保证蛋白组的得率和蛋白鉴定量，并且在蛋白提取步骤用rnalater对rna进行保护，也可避免提取完蛋白后rna的严重降解。

33、本方法s3中，所述用于蛋白组提取的裂解液是指用depc水配制的能够进一步裂解样本，释放生物大分子(主要针对蛋白质，也包括rna和dna)到溶液中，从而提取样本中的生物大分子的溶液，只要是蛋白组提取时的裂解液配方均可，其实例包括但不限于，尿素裂解液，sds裂解液，等等。

34、在一些实施方式中，所述尿素裂解液可以是由depc水配制的含100mm碳酸氢铵的8m尿素溶液。

35、在一些实施方式中，所述尿素裂解液可以是由depc水配制的含100mm碳酸氢铵的6m尿素、2m硫脲的溶液。

36、在一些实施方式中，所述尿素裂解液可以是由depc水配制的含100mm碳酸氢铵的10m尿素溶液。

37、在一些实施方式中，所述尿素裂解液可以是由depc水配制的含100mm碳酸氢铵的6m尿素溶液。

38、在一些实施方式中，所述尿素裂解液可以是由depc水配制的含100mm三乙基碳酸氢铵的8m尿素溶液。

39、在一些实施方式中，所述尿素裂解液可以是由depc水配制的含100mm三乙基碳酸氢铵的6m尿素、2m硫脲的溶液。

40、在一些实施方式中，所述尿素裂解液可以是由depc水配制的100mm三乙基碳酸氢铵的10m尿素水溶液。

41、在一些实施方式中，所述尿素裂解液可以是由depc水配制的含100mm三乙基碳酸氢铵的6m尿素溶液。

42、在一些实施方式中，所述裂解液可以是由depc水配制的含表面活性剂的裂解液，配方主要包括盐类(如氯化钠、磷酸氢二钾等)、界面活性剂(如十二烷基硫酸钠、np-40、tween-20、triton x-100等)、蛋白酶抑制剂(如苯甲氨基甲酸甲酯)和缓冲液(如tris-hcl缓冲液)。

43、在一些实施方式中，所述含表面活性剂的裂解液可以是由depc水配制的十二烷基酸钠裂解液。

44、在一些实施方式中，所述含表面活性剂的裂解液可以由depc水配制的含150mm氯化钠、1％ triton x-100、0.5％脱氧胆酸钠、0.1％十二烷基酸钠、50mm tris的溶液。

45、在一些实施方式中，所述含表面活性剂的裂解液可以由depc水配制的含150mm氯化钠、1％ np-40、50mm tris的溶液。

46、在一些实施方式中，所述含表面活性剂的裂解液可以由depc水配制的含150mm氯化钠、1％ np-40、50mm triton x-100的溶液。

47、本方法s3中，在0-4℃下进行超声处理，可以在样本裂解的时候促进生物大分子的释放，这是因为该方法较常规的接触式超声法更为温和，接触式超声法会导致rna、dna降解以及dna的碎片化。若有其他的在低温环境下的样本裂解促进生物大分子释放的方式也是适配本方法的，如covaris的聚焦超声仪等(但covaris的聚焦超声仪价格比本方法中采用的普通超声仪要贵很多，该设备的普及率也不高，且需要配套耗材，耗材价格也昂贵，成本高)。超声处理的条件没有特别限定，只要是低温(不能到达结冰的程度)超声即可，超声处理时间也没有特别限定，可以为5-20分钟，例如，4℃超声10分钟。

48、在一些实施方式中，本方法s3包括以下步骤：

49、s3-1，将s2中得到的主要含有蛋白组、磷酸化蛋白组、转录组和基因组的部分加入rna保护试剂(例如，rnalater)并混匀，再加入用于蛋白组提取的裂解液并混匀；

50、s3-2，在0-4℃下进行超声处理；

51、s3-3，对s3-2中完成超声的样本进行孵育处理(例如，振荡孵育，例如在1000-2000rpm下振荡孵育10-20分钟)；

52、s3-4，对s3-3中完成孵育的样本进行离心，得到上清和沉淀；

53、s3-5，取部分s3-4中得到的上清进行蛋白组提取，得到蛋白质组。

54、在一些实施方式中，本方法s3-1中，用于蛋白组提取的裂解液可以是用depc水配制的含100mm碳酸氢铵的8m尿素溶液。

55、在一些实施方式中，本方法s3-1中，用于蛋白组提取的裂解液的用量没有特别限制，只要能够实现其进一步破碎样本，释放生物大分子(主要针对蛋白质，也包括rna和dna)到溶液中，从而提取样本中的生物大分子的目的即可，例如，可以(如按50μl/mg组织的量)加入经冰上预冷的裂解液。

56、在一些实施方式中，本方法s3-2中，可以在0-4℃下，在10-50hz(优选40hz)下超声5-20分钟(优选10分钟)。

57、在一些实施方式中，本方法s3-3中，可以在4℃，1000-2000rpm下振荡孵育10-20分钟。

58、在一些实施方式中，本方法s3-4中，可以在0-4℃、16000-18000g下离心5-20分钟。

59、本方法s3和s3-5中，取上清进行蛋白质组提取的方法没有特别限制，可以使用本领域通用的蛋白质提取方法。

60、在一些实施方式中，本方法s3-5包括以下步骤：

61、s3-5-1，取部分s3-4得到的上清，加入还原试剂(例如，三(2-羧乙基)膦盐酸盐)并混匀，再进行振荡孵育(例如，在水平振荡仪中(例如，以32℃、800rpm)振荡孵育(例如，1小时))；

62、s3-5-2，向s3-5-1中完成孵育的混合物中加入烷基化试剂(例如，碘乙酰胺)并混匀，再进行黑暗环境孵育(例如在水平振荡仪中(例如，以32℃、800rpm)黑暗环境振荡孵育(例如，1小时))；

63、s3-5-3，向s3-5-2中完成孵育的混合物中加入100mm碳酸氢铵水溶液使尿素浓度从8m稀释至1.6m以下，混匀，然后瞬离；

64、s3-5-4，向s3-5-3中完成稀释的混合物中加入胰酶和可选择的胞内蛋白酶lys c并混匀，再进行孵育(例如，在水平振荡仪中(例如，以32℃、600rpm)振荡孵育)；

65、s3-5-5，向s3-5-4中完成孵育的混合物，再次加入胰酶和可选择的胞内蛋白酶lysc并混匀，再进行孵育(例如，在水平振荡仪中(例如，以32℃、600rpm)振荡孵育)；

66、s3-5-6，将s3-5-5中完成孵育的混合物经瞬离，再加入10％三氟乙酸水溶液并混匀；

67、s3-5-7，对s3-5-6完成酶解的样本进行除盐；

68、s3-5-8，对s3-5-7中经除盐的样本进行干燥；

69、s3-5-9，对s3-5-8中经干燥的样本进行复溶；

70、s3-5-10，对s3-5-9中经复溶的样本进行浓度调节；

71、s3-5-11，对s3-5-10中经浓度调节的样本进行离心，收集上清得到多肽，用于蛋白组下游分析。

72、在一些实施方式中，s3-5-4中，胰酶和可选择的胞内蛋白酶lys c的添加量没有特别限制，只要按照蛋白组酶解常规操作即可。在一些实施方式中，可以以胰酶/蛋白质总量＝1/40添加胰酶。

73、在一些实施方式中，本方法s3-5-7包括以下步骤：

74、(1)将s3-5-6得到的混合物在室温、16000-18000g下离心15分钟；

75、(2)取新的c18除盐柱，将其置于离心管上组成除盐套组；

76、(3)向(2)中的c18除盐柱中加入甲醇，离心(例如，以室温、70g离心3分钟)，弃离心管中的流出液；

77、(4)向(3)中的c18除盐柱中加入含0.1％三氟乙酸的80％乙腈水溶液(含0.1％三氟乙酸)，离心(例如，以室温、70g离心3分钟)，弃离心管中的流出液；

78、(5)向(4)中的c18除盐柱中加入含0.1％三氟乙酸的2％乙腈水溶液，离心(例如，以室温、70g离心3分钟)，弃离心管中的流出液；

79、(6)向(5)中的c18除盐柱中加入(1)中经过离心的样本上清，离心(例如，以室温、70g离心3分钟)，弃离心管中的流出液；

80、(7)向(6)中的c18除盐柱中加入含0.1％三氟乙酸的2％乙腈水溶液，离心(例如，以室温、70g离心3分钟)，弃离心管中的流出液，其中重复该步骤共进行2-8次；

81、(8)将(7)中的c18除盐柱置于新的离心管上组成新的除盐套组；

82、(9)向(8)中的c18除盐柱中加入含0.1％三氟乙酸的60％乙腈水溶液，离心(例如，以室温、70g离心3分钟)，收集流出液，重复该步骤共进行2次，得到经除盐的样本。

83、在一些实施方式中，本发明方法s3-5-8中将s3-5-7收集的经除盐的样本离心浓缩至彻底干燥。干燥后若不立即分析则置于-80℃冰箱冻存。

84、在一些实施方式中，本发明方法s3-5-9中，取s3-5-8中干燥后的样本，加入含0.1％甲酸的2％乙腈水溶液(均为质谱级)，使样本充分溶解。

85、在一些实施方式中，本发明方法s3-5-10中，对s3-5-9复溶的样本使用超微量核酸蛋白测定仪进行多肽浓度检测，并根据检测结果将样本的多肽浓度调节成需要的数值(多肽浓度与后续液相质谱检测方法相关)，本方法中将多肽浓度调节为1μg/μl、250ng/μl或125ng/μl。

86、在一些实施方式中，本发明方法s3-5-11中，将s3-5-10中调节完浓度的样本离心(例如，在高速离心机中，以室温、18000g离心20分钟)，收集收集上清得到多肽。

87、在一些实施方式中，本方法中s3中，除了蛋白组提取进行还原、烷化、酶解步骤以外的其他操作均在0-4℃的环境下进行。

88、本方法s4中，进行磷酸化蛋白组富集的方法没有特别限制，可以使用本领域公知的富集方法，例如，可以使用固相金属亲和色谱法，如基于ti4+-imac的磷酸化肽段富集方法，该方法常用、简便、成本低、效果好。也可以使用其他富集方法，如其他固相金属亲和色谱法(如fe3+-imac、nb5+-imac、zr4+-imac等)，金属氧化物亲和色谱法(如tio2-moac、zro2-moac、sio2-moac、al(oh)3-moac等)，基于抗原抗体亲和相互作用的免疫沉淀法，化学衍生法(β消去法、氨基磷酸酯化学法等)、基于色谱分离方法(如强/阴离子交换色谱法、亲水相互作用色谱法、静电排斥液相作用色谱法等)等，都可以选择作为磷酸化蛋白组的富集方法。在一些实施方式中，s4使用基于ti4+-imac的的磷酸化肽段富集方法进行。本方法s4包括以下步骤：

89、s4-1，ti4+-imac材料准备：

90、①ti4+螯合：称量单分散固定化亲和色谱微球cae-ti-imac(优选地，按照肽段/微球材料质量比＝1/20至1/40称量)，加入0.625g/ml的硫酸钛溶液(优选地，按照微球材料质量/硫酸钛溶液体积＝1mg/0.05ml-1mg/1ml比例添加)，旋转孵育14小时以上(例如，在转盘中常温孵育)，然后离心(例如，以5000g常温离心1分钟)，弃上清。

91、②孵育后清洗ⅰ：加入0.1％三氟乙酸水溶液，离心，弃上清，其中，重复该步骤共进行6次，(优选地，添加10-20倍单分散固定化亲和色谱微球体积的0.1％三氟乙酸水溶液，摇匀，离心(例如，5000g常温离心1分钟)，弃上清，重复洗涤共6次)。

92、③孵育后清洗ⅱ：加入含200mm nacl的0.1％三氟乙酸水溶液，离心，弃上清，其中，重复该步骤共进行2次(优选地，添加10-20倍单分散固定化亲和色谱微球体积的含200mm nacl的0.1％三氟乙酸水溶液，摇匀，离心(例如，5000g常温离心1分钟)，弃上清，重复洗涤共2次)。

93、④孵育后清洗ⅲ：加入0.1％三氟乙酸水溶液，离心，弃上清，其中，重复该步骤共进行2次(优选地，添加10-20倍单分散固定化亲和色谱微球体积的0.1％三氟乙酸水溶液，摇匀，离心(例如，5000g常温离心1分钟)，弃上清，重复洗涤共2次)。

94、⑤材料重悬：加入0.1％三氟乙酸水溶液重悬材料，得到准备好的ti4+-imac材料(优选地，每mg材料添加10μl 0.1％三氟乙酸水溶液重悬材料，得到准备好的ti4+-imac材料)。

95、s4-2，取部分s3得到的多肽，旋转蒸发至完全干燥状态。

96、s4-3，向s4-2得到的干燥多肽中加入含40％乙腈、3％三氟乙酸和50mm碳酸氢铵的水溶液进行复溶，再加入s4-1中准备好的ti4+-imac材料进行孵育(例如，在转盘中室温下旋转孵育20分钟)，然后离心(例如，以6000g常温离心3分钟)，弃上清。

97、s4-4，向s4-3得到的混合物中加入含50％乙腈、6％三氟乙酸和200mm nacl的水溶液，进行孵育(例如，在转盘中室温下旋转孵育5分钟)，然后离心(例如，以6000g常温离心3分钟)，弃上清，其中，重复该步骤共进行4次。

98、s4-5，向s4-4得到混合物中加入含30％乙腈的0.1％三氟乙酸水溶液，进行孵育(例如，在转盘中室温下旋转孵育5分钟)，然后离心(例如，以6000g常温离心3分钟)，弃上清。

99、s4-6，向s4-5得到的混合物中的1.5ml离心管加入10％氨水溶液，进行孵育(例如，在转盘中室温下旋转孵育10分钟)，然后离心(例如，以6000g常温离心3分钟)，收集上清，加入10％甲酸水溶液，其中，重复该步骤共进行2次。

100、s4-7，取新的c18除盐柱，将其置离心管上组成除盐套组；

101、s4-8，向s4-7中的c18除盐柱中加入甲醇，离心(例如，以室温、72g离心3分钟)，弃流出液；

102、s4-9，向s4-8中的c18除盐柱中加入含0.1％三氟乙酸的80％乙腈水溶液，离心(例如，以室温、72g离心3分钟)，弃流出液；

103、s4-10，向s4-9中的c18除盐柱中加入含0.1％三氟乙酸的2％乙腈水溶液，离心(例如，以室温、72g离心3分钟)，弃流出液；

104、s4-11，向s4-10中的c18除盐柱中加入s4-6得到的样本上清，离心(例如，以室温、72g离心3分钟)，弃流出液；

105、s4-12，往s4-11中的c18除盐柱中加入含0.1％三氟乙酸的2％乙腈水溶液，离心(例如，以室温、72g离心3分钟)，弃流出液，其中重复该步骤共进行2-8次；

106、s4-13，将s4-12得到的c18除盐柱置于新的离心管上组成新的除盐套组；

107、s4-14，向s4-13中的c18除盐柱中加入含0.1％三氟乙酸的60％乙腈水溶液，离心(例如，以室温、72g离心3分钟)，重复该步骤共进行2次，收集流出液；

108、s4-15，对s4-14中经除盐的样本进行干燥；

109、s4-16，对s4-15中经干燥的样本进行复溶；

110、s4-17，对s4-16中经复溶的样本进行进行离心，收集上清得到磷酸化多肽。

111、在一些实施方式中，本发明方法s4-15中，将收集的流出液管至离心浓缩仪中，离心浓缩至彻底干燥，干燥后若不立即分析则置于-80℃冰箱冻存。

112、在一些实施方式中，本发明方法s4-16中，取s4-15中干燥后的样本管，加入2％乙腈(含有0.1％甲酸，均为质谱级)，将样本管涡旋1分钟，使得样本充分溶解而进行复溶。在一些实施方式中，本发明方法s4-17中，将样本管转移至高速离心机中，以室温、16000-18000g离心(例如，20分钟)，转移离心后的上清至聚丙烯进样瓶中，由此得到磷酸化多肽，以待液相质谱分析。

113、本方法s5中，进行转录组提取的方法没有特别限制，可以使用本领域公知的提取方法，例如，可以使用基于trizol的方法，该方法最常用、简便、成本低。也可以使用其他提取方法，如梯度密度离心法、离子交换法、盐析法、硅胶模法等，还有很多市售的相关转录组提取试剂盒等，都可以选择作为转录组的提取方法。在一些实施方式中，s5使用基于trizol的转录组提取方法进行。本方法s5包括以下步骤：

114、s5-1，取部分s3得到的上清，加入trizol并混匀，静置孵育(例如，在室温下静置孵育(例如，3分钟))；

115、s5-2，在0-4℃下，将s5-1孵育完的样本瞬离，加入氯仿并混匀，在冰上静置分相(例如，3分钟)；

116、s5-3，在0-4℃下，将s5-2分相后的样本离心(例如，以4℃，16000-18000g离心(例如，15分钟))，收集上清；

117、s5-4，在0-4℃下，在s5-3收集的上清的样本管中加入异丙醇和糖原并混匀，在-20℃孵育(例如，1小时)；

118、s5-5，在0-4℃下，将s5-4中孵育完的样本离心(例如，以4℃、16000-18000g离心(例如，15分钟))，收集沉淀；

119、s5-6，在s5-5的沉淀中加入75％乙醇(depc水配制)，离心(例如，以4℃、11000-12000g离心(例如，5分钟))，弃上清，其中，重复该步骤共进行2次；

120、s5-7，将s5-6得到的沉淀风干(例如，在室温风干3分钟)；

121、s5-8，在s5-7风干后的沉淀中加入depc水复溶，得到转录组。

122、任选地，本方法s5可以进一步包括：

123、s5-9，各吸取s5-8中复溶的样本，进行rna浓度和完整度检测。余下样本可以转移至-80℃冻存，以待后续测序分析。

124、本方法s5-9中，可以使用商业化试剂盒，例如，qubit rna hs试剂盒，然后使用qubit仪器进行rna浓度检测；也可以使用nanodrop仪器直接进行rna浓度检测。

125、本方法s6中，进行基因组提取的方法没有特别限制，可以使用本领域公知的提取方法，例如，基于酚氯仿异戊醇的方法，该方法最常用、简便、成本低。也可以使用其他的提取方法，如浓盐法、sds法、ctab法、水抽提法等，还有很多市售的相关基因组提取试剂盒等，都可以选择作为基因组的提取方法。

126、在一些实施方式中，s6使用基于酚氯仿异戊醇的基因组提取方法进行。本方法s6包括以下步骤：

127、s6-1，(优选地，在室温下)取s3中得到的沉淀，加入dna消化液、蛋白酶k并混匀；

128、s6-2，将s6-1的样本孵育(例如，在水平振荡仪中，(例如，以55℃、0rpm)孵育(例如，1-2小时))至沉淀消化完毕；

129、s6-3，取s6-2完成消化的样本瞬离，加入苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为25/24/1)，混匀，并分相(例如，在室温下，静置分相(例如，10分钟))；

130、s6-4，将s6-3中的样本离心(例如，以室温、16000-18000g离心(例如，5-15分钟))，收集上清；

131、s6-5，在s6-4得到的上清中加入乙醇混匀，在-20℃孵育(例如，1小时)；

132、s6-6，将s6-5中完成孵育的样本离心(例如，以室温、16000-18000g离心(例如，5-10分钟))，弃上清；

133、s6-7，在s6-6离心后的沉淀中加入70％乙醇(超纯水配制)，离心(例如，以室温、11000-12000g离心(例如，5分钟))，弃上清，其中，重复该步骤共进行2次；

134、s6-8，将s6-7得到的沉淀干燥(例如，在水平振荡仪中，在37-55℃、0rpm下，打开管盖干燥沉淀2-3分钟)；

135、s6-9，在s6-8干燥后的沉淀中加入超纯水，复溶，得到基因组。

136、任选地，本方法s6可以进一步包括：

137、s6-10，各吸取s6-9中复溶的样本，进行dna浓度和完整度检测。

138、本方法s6-10中，可以使用商业化试剂盒，例如，qubit 1×dna hs试剂盒，然后使用qubit仪器进行dna浓度检测；也可以使用nanodrop仪器直接进行dna浓度检测。

139、本发明取得了以下有益技术效果：

140、1.解决组织异质性带来的系统性误差：本方法只需单份样本，避免了样本分割提取引入的组织异质性问题。

141、2.提取所需样本起始量低：对于组织样本，低至10mg，甚至低至5mg新鲜组织样本；对于细胞样本，低至1×107个细胞，甚至低至1×106个细胞；对于体液样本低至1ml体液(如血液)，甚至低至100μl体液(如血液)。

142、3.提取的组学成分种类多：本方法可从单份样本中连续提取获得六种组学成分，脂质、代谢物、蛋白质、磷酸化蛋白质、dna、rna。

143、4.成本低：本方法不需要使用昂贵的商业化试剂盒，成本低。

144、5.所需仪器常见。