一种阿尔兹海默症pTau181化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法及其检测方法与流程

本发明属于免疫检测，具体涉及一种阿尔兹海默症ptau181化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法及其检测方法。

背景技术：

1、阿尔兹海默症(alzheimer's disease，ad)是一种起病隐匿、呈缓慢渐进性加重的神经系统退行性疾病，常见于65岁以上老年人，发病率随年龄增长而显著增加。ad特征性病理改变目前被广泛接受的致病假说有：aβ聚集假说、tau蛋白异常假说、胆碱能假说、神经炎症假说等，其中tau蛋白的磷酸化修饰在该疾病进程中至关重要，tau和app可以在多个位点发生磷酸化修饰，根据不同的磷酸化位点主要分为t-tau、ptau-181、ptau-217、ptau-231。这些生物标志物也可以更快、更少地在血浆中进行测量，并可为阿尔茨海默症的早期诊断提供形成的重要依据。

2、目前ad的诊断方法主要是联合诊断，包括：神经心理学评估，认知损伤测试；脑部老年斑块和tau蛋白pet扫描；脑部核磁共振(mri)和脑脊液(csf)标志物，aβ沉积，磷酸化tau蛋白检测等。但是，由于ad早期症状不明显，当对病症做出明确诊断时，患者多到达病程晚期，多数神经元出现死亡，如果能在病人发病早期进行快速诊断或使潜在病人提前发现风险，针对性地进行治疗或预防，能有助于患者病程滞留在轻微智力损伤阶段(mildcognitive impairment，mci)而减缓恶化，从而保证病人生活质量和减轻社会负担。因此，如何提供一种ptau-181的检测试剂和检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、本发明要解决的问题是现存的阿尔茨海默症检测试剂盒操作复杂、耗费昂贵、检测时间长、灵敏度低、精密度差、缺少对阿尔茨海默症的准确预测能力等问题，提出一种阿尔兹海默症ptau181化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法及其检测方法。

2、为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

3、一种阿尔兹海默症ptau181化学发光免疫分析试剂盒，所述试剂盒包括磁微粒试剂、ae标记的ptau-181抗体、ptau-181校准品，所述磁微粒试剂为包被有ptau-181抗体的磁性微球混悬液；所述ae标记的ptau-181抗体通过吖啶酯对ptau-181抗体进行标记得到。

4、进一步的，所述磁微粒试剂中的磁微粒的粒径为1-3μm，所述磁微粒表面包裹有羧基活性基团的磁性微球；

5、所述ptau-181抗体的磁性微球混悬液制备时按照每50mg磁性微球加入0.5-2.5mg的ptau-181抗体进行包被，所述磁微粒试剂中ptau-181抗体与羧基磁珠的质量比为1: 20-100，连接反应的温度为室温，连接反应的时间为16～20h。

6、进一步的，所述ae标记的ptau-181抗体中ptau-181抗体与吖啶酯的质量比为1:1。

7、一种阿尔兹海默症ptau181化学发光免疫分析试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

8、步骤1. 制备磁微粒试剂；

9、步骤1.1. 将羧基磁珠溶液在磁微粒缓冲液的作用下进行分散处理，得到分散的羧基磁珠溶液；

10、步骤1.2. 将分散的羧基磁珠溶液和ptau-181抗体进行连接反应，得到连接产物；

11、步骤1.3. 将连接产物置于磁场中，用磁微粒缓冲液冲洗，制得连接有ptau-181抗体的磁微粒溶液；

12、步骤2. 制备ae标记的ptau-181抗体；

13、步骤2.1. 用0.15m的碳酸氢钠缓冲液将ae配成浓度为5mg/ml的ae溶液；

14、步骤2.2. 将小鼠单克隆抗ptau-181抗体和ae溶液按照质量比为1:1混合，进行链接反应，得到ptau-181抗体与ae的链接产物；

15、步骤2.3. 将ptau-181抗体与ae的链接产物用ph为8～9的碳酸盐缓冲液分离纯化，得到ae标记的ptau-181抗体；

16、步骤3. 制备ptau-181校准品：所述ptau-181校准品为含有ptau-181抗原、质量百分含量为0.5％的bsa、质量百分含量为0.05％的prolin300的tris缓冲液；所述ptau-181抗原的浓度分别为20pg/ml和200pg/ml。

17、进一步的，步骤1.1中将羧基磁珠浓缩液置于磁场内1～3min，待羧基磁珠全部沉降后除去上层清液，然后加入到磁微粒缓冲液振荡后，置于磁场中1～3min后，除去上层清液；振荡时间设置为20～30min；羧基磁珠和磁微粒缓冲液的体积比为1:2～5，分散处理次数为3次。

18、进一步的，步骤1.2的互通实现方法包括如下步骤：

19、步骤1.2.1. 按照质量比为100:5～100：1称量分散的羧基磁珠溶液和ptau-181抗体的，分散的羧基磁珠溶液的浓度为10～50mg/ml，设置连接反应的温度为室温，连接反应的时间为16～20h；

20、s1.2.2. 连接反应完成后添加封闭液进行封闭，封闭液的配方为：pbs、3wt%的bsa、1wt%tween-20、1wt%的麦芽糖、5wt%的山梨醇、2wt%的蔗糖、3wt%的甘油、0.1～0.8wt的%peg600的混合溶液。

21、进一步的，步骤1.3中所述连接产物置于磁场的时间为5～10min，然后用磁微粒缓冲液冲洗，制得连接有ptau-181抗体的磁微粒溶液。

22、一种阿尔兹海默症ptau181化学发光免疫分析试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

23、s1. 准备磁微粒试剂、ae标记的ptau-181抗体；

24、s2. 将血清样本与步骤s1准备的ae标记的ptau-181抗体加入到磁微粒试剂中进行孵育；

25、s3. 孵育完成，待磁微粒试剂沉降后，除去上清液，清洗，然后加入底物溶液振荡混匀，检测相对发光强度。

26、进一步的，步骤s2中的血清样本、ae标记的ptau-181抗体和磁微粒试剂的体积比为2:2:1。

27、进一步的，步骤s3中检测相对发光强度后，经高、低值两点校准品进行定标校准，拟合生成新的工作曲线，用于样本测定；将ptau-181质控品作为样本，利用工作曲线进行浓度拟合，得到相应质控品浓度，观察拟合质控品浓度为标准浓度值的±30％。

28、本发明的有益效果：

29、本发明所述的一种阿尔兹海默症ptau181化学发光免疫分析试剂盒，所述ptau-181试剂盒使用磁珠为固相，使免疫反应更接近液相，反应更充分和迅速，而且使结合的免疫复合物更加容易分离，降低了非特异性吸附。本发明使用的ae标记抗体试剂为单克隆抗体混合物，使免疫反应的亲和力更高，而且单抗的生产批间差异相对小，更容易保证产品的批间稳定。

30、一种阿尔兹海默症ptau181化学发光免疫分析试剂盒，为快速、准确的ptau-181检测提供了可能，本发明对样品的前处理要求低，前处理过程简单，能快速、高通量检测大批样品，检验方法方便易行，填补了现有技术中的空白。

31、一种阿尔兹海默症ptau181化学发光免疫分析试剂盒，将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，具有更高的检测灵敏度、特异性、精确度和准确性，并达到了较佳的性能参数。试剂盒中的磁微粒试剂、ae标记抗体、校准品是该反应体系下的最优配方，给试剂盒的使用效期及检测性能提供了有力保障。