用Pickering乳液法制备细胞膜的方法与流程

本发明涉及pickering乳液，具体涉及一种用pickering乳液法制备细胞膜的方法。

背景技术：

1、人工获取细胞膜的主要方法有两类：一是自下而上法，包括制备脂质双分子层，然后逐渐加入其他修饰材料如蛋白质、核酸，最终形成类似于天然细胞的复杂结构。二是自上而下法，从高分子基质出发，逐步引入低分子量组分，最终形成相应的复杂结构。在人工细胞膜的制备材料方面：最早，科研人员尝试用构成细胞膜的脂质制单层或多层脂质囊泡，并将其应用于检查特定肽链对脂质膜动力学、功能或其他的影响特性，或是用于模拟从真核细胞到细胞器或细菌的生物形式。后来，具有高渗透性、高横向迁移率和低生物毒性特点的磷脂被广泛用作组装guv（巨型单层囊泡）的仿生材料，研究发现，由磷脂材料组成的guv衍生的人工细胞具有较大的酶包装容量，有一定的应用前景。然而，由纯磷脂组成的脂质囊泡只能模仿细胞形状并将内容物与外界隔离开来，与真实的细胞结构相去甚远。为了使人造细胞更加“逼真”并执行特定的细胞功能，研究人员将可以通过调节膜的脂质组成来调节活性的膜蛋白添加到磷脂双层中。在这之后，研究人员尝试从天然细胞中提取含有天然蛋白质和小分子的膜制剂作为人工细胞膜的组装原料。除此以外，脂肪酸已成为研究细胞初始形式的重点。脂肪酸是单链两亲性分子，可以在水中形成双层、囊泡和胶束。然而，这种材料的低稳定性和苛刻的化学改性条件限制了其在人工细胞中的进一步发展和更广泛的应用。

2、申请人采用pickering乳液法来提升脂肪酸改性的多肽的稳定性以制备人工细胞膜。

3、二十世纪初，ramsden(1903)发现固体微粒可以稳定乳液，随后pickering等人(1907)用硫酸铜和硫酸铁等胶体粒子稳定水和石蜡体系，并系统地探究了固体粒子在稳定乳液方面的应用。证实超细的固体微粒可以稳定地存在于水/油界面，起到稳定乳液的作用，这种乳液被命名为“pickering乳液”，即用固体粒子全部或部分替代表面活性剂稳定的乳液。pickering乳液通过固体粒子不可逆的吸附在油水两相界面，形成的稳定乳液。，如图1所示，在本专利中pickering乳液法让多肽进行折叠形成生物结构。

技术实现思路

1、本专利可组装成具有亲水和亲异辛醇表面特性的janus纳米纤维的两亲性多肽作为仿生细胞膜的材料。接着采取pickering乳液法在异辛醇/水中制备油包水的乳液，并利用多肽纤维稳定该乳液；最后，使用原位交联法，在不改变纤维原有位置的前提下使纤维之间产生新的化学键，以稳定其膜结构，并将原有的溶剂置换，最终形成具有封闭膜结构的仿生细胞膜。

2、本发明提供了一种用pickering乳液法制备细胞膜的方法，该方法包括：

3、(1)制备多肽：采用固相法制备如式i所示的多肽，

4、(i)。

5、(2)制备两性多肽：在i的多肽的氨基端偶联氨基十一酸形成两性多肽。

6、(3)制备亲异辛醇多肽：在两性多肽的羧基端缩合4-四乙二醇单甲氧基苯甲酰胺（4-(2,5,8,11-tetraoxatridecan-13-yloxy)benzamide）得到亲异辛醇多肽（具有亲水和亲异辛醇的表面，为janus纳米纤维结构）。

7、(4)纯化：对亲异辛醇多肽进行纯化。

8、(5)折叠：将纯化后的亲异辛醇多肽采用pickering乳液法进行折叠，形成稳定的溶液体系。

9、(6)制备膜结构：在步骤(5)得到的乳液中加入戊二醛，再依次分离油相和水相得到膜结构。

10、具体地，步骤(1)采用fmoc固相合成法，以hbtu和dipea作为催化剂。fmoc固相合成法为多肽合成的常规方法，本实施例省略详细描述。

11、进一步地，步骤(2)和(3)均在固相法所用的树脂上进行（合成方法与步骤(1)类似），反应完成后，采用三氟乙酸/水/三异丙基硅烷的混合物将多肽分子从树脂上裂解，减压蒸馏，再经乙醚析出，干燥，得到多肽粗品。其中，三氟乙酸、水和三异丙基硅烷的体积比为92：1-3：2-4。

12、其中，步骤(4)具体包括：将多肽粗品送入液相色谱柱（具体可以为c18），以水和乙腈的混合物作为流动相，梯度洗脱，减压蒸馏去除乙腈，冻干得到多肽精品。其中，水和乙腈的混合物中乙腈的体积浓度为5-95%；具体地，乙腈的体积浓度为5%、20%、35%、50%、65%、80%和95%。

13、其中，步骤(5)具体包括：将多肽精品加入异辛醇/水混合乳液中，500-700rpm下搅拌7-10小时。其中，异辛醇与水的体积比为1-3：10，多肽精品的浓度为0.5-1.0mg/ml。

14、其中，步骤(6)具体包括：戊二醛的用量为多肽精品的10-30%，10000-12000rpm下高速搅拌45-60s。

15、具体地，本发明提供的用pickering乳液法制备细胞膜的方法包括：

16、(1)制备多肽：采用fmoc固相合成法，以hbtu和dipea作为催化剂，制备如式i所示的多肽，

17、(i)。

18、(2)制备两性多肽：在i的多肽的氨基端偶联氨基十一酸形成两性多肽。

19、(3)制备亲异辛醇多肽：在两性多肽的羧基端缩合4-四乙二醇单甲氧基苯甲酰胺得到亲异辛醇多肽，反应完成后，采用三氟乙酸/水/三异丙基硅烷的混合物将多肽分子从树脂上裂解，减压蒸馏，再经乙醚析出，干燥，得到多肽粗品；所述三氟乙酸、水和三异丙基硅烷的体积比为92：1-3：2-4。

20、(4)纯化：将多肽粗品送入液相色谱柱，以水和乙腈的混合物作为流动相，梯度洗脱，减压蒸馏去除乙腈，冻干得到多肽精品；所述水和乙腈的混合物中乙腈的体积浓度为5-95%。

21、(5)折叠：将多肽精品加入异辛醇/水混合乳液中，500-700rpm下搅拌7-10小时得到含有β折叠的多肽乳液，所述异辛醇与水的体积比为1-3：10，所述多肽精品的浓度为0.5-1.0mg/ml。

22、(6)制备膜结构：在步骤(5)得到的乳液中加入戊二醛，戊二醛的用量为多肽精品的10-30%，10000-12000rpm下高速搅拌45-60s，再依次分离油相和水相得到膜结构。

23、本专利制备的细胞膜具有如下优势：

24、(1)本专利制备的细胞膜囊泡呈球状，平均大小为7-12μm，膜厚度为3-7nm。室温下，五天后细胞膜囊泡的平均大小小0.1-0.3μm，细胞膜囊泡无融合和破碎现象。4℃下，存储360天，细胞膜囊泡的形态保持完整，细胞膜囊泡的平均大小变化小于1μm。即本专利的细胞膜囊泡非常稳定。

25、(2)步骤(5)后，利用透射电子显微镜来观察多肽的聚集（观察到多肽呈纤维状聚集，为janus结构）和折叠情况；用醋酸双氧铀来对多肽结构进行染色，利用圆二色光谱对多肽的折叠情况进行检测，观察到超过70%的多肽均按设计要求进行折叠。

26、(3)荧光标记的葡聚糖能从细胞膜囊泡的外部进入内部，证明细胞膜对葡聚糖具有透过性。