一种肾功三联检测测试卡及对应的校准方法和系统与流程

本发明涉及肌酐定量检测，具体为一种肾功三联检测测试卡及对应的校准方法和系统。

背景技术：

1、尿素，尿酸及肌酐是人体肾脏损伤评估重要指标，也是很多疾病特别是慢性肾功能衰竭，尿毒症等诊断、治疗和疾病评估的重要指标。尿素，尿酸及肌酐通常同时用于肾脏和疾病评估。目前医院等中心实验室普遍采用生化分析仪来测试人体血液尿素，尿酸及肌酐浓度。生化分析仪测量精确，结果可靠，但仪器昂贵，体积较大，配套液体试剂多，需经常维护，不适合紧急救援等恶劣环境使用；市面上常用的肾功项目分析仪常采用干化学、电化学原理，多为单一项目，一次只能检测一个项目，测量时间长，测量精度不够高。

2、临床上肾脏损伤等常伴有尿素，尿酸及肌酐异常，人血清中尿素，尿酸及肌酐含量的测定是临床检测的一个重要内容，其对疾病的治疗和预后的判断具有重要的临床意义。因此，血样尿素、尿酸及肌酐浓度检测方法得到了广泛而深入的研究，学者和工程师们提出各种办法来评估：①《clin chem》1983年第29卷第8期1494-1496页，通过对测试程序中设置样品空白管，通过与空白管差值的方法实现人血肌酐准确测试；②《clin chimacta》1984年第143卷第2期147-155页，应用双试剂方法，在第一步就去消耗完内源性干扰物质肌酸。将样本加入试剂1中(不加肌酐酶)进行反应消耗掉样本中内源性肌酸后，再加入试剂2(除加肌酐酶外，其他的试剂2与试剂1基本一致)进行反应，在加入试剂2后才进行信号值获取用来计算肌酐的测试结果，在本质上也是减去肌酸的反应结果；③《临床检验杂志》1999年第17卷第2期71-73页，应用的肌酐商品双试剂法，即首先消耗掉内源性肌酸，再实现肌酐测试；④专利cn114774256b采用双孔设计，采用双孔信号差值方法测量人血肌酐含量；⑤专利cn102757893a公开了一种时间差肌酐测试方法。将2中试剂固定在干式测试卡上，利用2种试剂的反应时间差，即首先反应掉样品中的内源性肌酸，时长180s。180s后，再进行人血肌酐测量；⑥专利cn109856131a以及cn116953213a公开了同时检测样本中尿酸、肌酐、尿素三合一的三孔测试卡及其制备方法，肌酐项目而言利用酶法的一种肌酸酶-肌氨酸氧化酶-过氧化物酶法。

3、现有技术中，①②③为肌酐常用检测方法，为湿化学分步法。该法显色快、结果稳定可靠、读取吸光度后可直接定值。但测量时间长，操作复杂不适合与尿素，尿酸联合测试；④将肌酐湿化学分步法干燥于干式测试卡上，其中④将2步所需试剂分别放入不同测试孔中，不同测试孔存在孔间测试差，多孔也会导致全血扩散不够稳定，不适合多项目联检；⑤则将2步所需试剂放入不同试纸层中，避免了孔间测试误差，一定程度上保证全血扩散的稳定性，但测量时间太长；⑥一次性可以检测三个项目就肌酐项目而言利用酶法的一种肌酸酶-肌氨酸氧化酶-过氧化物酶法，该方法会无法避免样本中的肌酸干扰，在低浓度范围测定肌酐时存在较大误差。

4、除此之外，上述项目的实际检测中，通常将一定体积的全血样本滴加在测试卡上，经过红细胞过滤，样本中的血浆/血清最终到达试剂层与指定试剂反应显色，显色深度与浓度成正比，对红细胞的体积并没有进行定量。测试卡上试剂量是一定的，为了保证测量结果的可重复及确定性，在测试过程中，会对全血体积进行定量，保证每一次参与测试的全血体积是一定的。但不同人同体积内的血细胞占比存在一定差异，正常男性红细胞比容为40％-50％；女性红细胞比容为37％-48％；新生儿红细胞比容为48％-68％。这就导致了，尽管加样的全血体积一定，但不同患者，测量时测试卡上最终所参与反应的血清/血浆体积却不一致，最终导致测量结果误差。

技术实现思路

1、发明目的：本发明针对上述现有技术中存在的问题，构建了一种肾功三联检测测试卡及对应的校准方法和系统，解决了测量时间长以及测量准确性差的问题。

2、技术方案：本发明的一方面，提供一种基于肾功三联检测测试卡的校准方法，该测试卡包括三个检测单元和校准检测单元，三个检测单元包括：尿素检测单元、尿酸检测单元、肌酐检测单元，所述校准检测单元用于样本内血清含量测量，根据样本信号值反馈的红细胞比容hct含量，对尿素检测单元、尿酸检测单元、肌酐检测单元的测试结果分别进行校准，所述校准方法包括以下步骤：

3、s1添加对应试剂后，获取尿素检测单元、尿酸检测单元、肌酐检测单元和校准检测单元对应的标准曲线；

4、s2根据尿素、尿酸在检测中的标准曲线，得到对应的初始浓度cur0，cua0；

5、获取肌酐检测单元对应的双波长反应曲线，从而构建初始浓度计算方程，得到对应的初始浓度ccr0；

6、s3获取校准检测单元的标准曲线对应的hct值，进而计算实际血清占比，并根据实际血清占比，得到对应的校准系数；

7、s4根据校准系数获取校准后尿素，尿酸及肌酐全血测量最终浓度cur，cua，ccr。

8、进一步的，包括：

9、所述步骤s2中，根据尿素、尿酸在检测中的标准曲线，得到对应的初始浓度cur0，cua0，具体包括：

10、前提条件：尿素与脲酶反应，其产物和显色剂结合显色为蓝色，有一个最佳吸收峰，信号值和浓度成正比；尿酸在尿酸酶的作用下生成过氧化物，产物与显色剂反应生成有色物质，有一个最佳吸收峰，信号值和浓度成正比；hct产物与显色剂反应生成有色物质，有一个最佳吸收峰，信号值和浓度成正比；

11、尿酸，尿素及hct的量化采用一元三次曲线模型：首先，制备等梯度浓度溶液，获取梯度溶液浓度；将上述梯度浓度于测试卡上测试，获取该浓度样本测试卡反射信号值，以浓度为x轴，反射信号值为y轴，分别构建3个项目梯度浓度-信号值标准曲线，从而用于尿酸，尿素项目信号值到初始浓度cur0，cua0及检测样本hct的计算。

12、进一步的，包括：

13、所述步骤s2中，获取肌酐检测单元对应的双波长反应曲线，从而构建初始浓度计算方程，得到对应的初始浓度ccr0，具体包括：

14、前提条件：内源性肌酸首先与肌酸脒基水解酶快速反应，反应曲线前期可见短暂平稳期信号，此时为内源性肌酸快速反应期，曲线末端为内源性肌酸与肌酐氨基水解酶作用下产生的肌酸信号的叠加，显色深度与检测浓度成正比；随着检测浓度增加，产物颜色变深，最佳吸收波长也发生了变化；

15、建立多参数方程：首先制备等梯度肌酐浓度溶液，获取梯度溶液浓度；将上述梯度浓度分别于测试卡上反应，获取测试卡肌酐孔位双波长反应曲线，再获取反应曲线空白段，前期稳定段及反应终点段内的信号值，以上述双波长多区间段内信号值为输入，对应浓度为输出，构建初始浓度ccr0计算方程。

16、建立多参数方程具体包括：

17、首先，分别获取曲线空白段，前期稳定信号段和反应终止段对应的波长1，波长2下反射信号值r0g，r0r，r1r，r2g，r2r，建立多参数方程：

18、

19、g(x3)＝k×(x3)3+l×(x3)2+m×(x3)+n；

20、其中，a，b，c，d，e，f，g，h，k，l，m和n为曲线系数，ccr0为肌酐初始浓度，r0r为波长2曲线空白段内信号值均值，r2r为波长2曲线反应终止段内信号值均值，f(x2)与g(x3)为高浓度及内源性肌酐补偿函数，r0g为波长1曲线空白段内信号值均值，r2g为波长1曲线反应终止段内信号值均值；r1r为波长2曲线前期稳定信号段内信号值均值；且曲线空白段为反应时间的前0～1s，前期稳定信号段为反应时间的前15-20s，反应终止段为反应时间的170-180s，且波长1是内源性肌酐计算的最佳波峰，波长2是一个补偿波长。

21、其中，g(x)用来做内源性肌酐补偿，f(x)用来做波长漂移补偿。因为整个线性区间比较宽，从低到高吸收峰发生了漂移。在实验中发现，在做方程拟合的时候不需要r1g，即波长1曲线前期稳定信号段内信号值均值，效果更佳。

22、进一步的，包括：

23、所述步骤s4具体包括：

24、实际血清占比hs表示为：

25、hs＝1-hct

26、其中，hct为该样本红细胞比容，即校准检测单元中的hct值；

27、则校准系数ks表示为：

28、

29、则尿酸，尿素及肌酐全血测量最终浓度cur，cua，ccr表示为：

30、cur＝ks×cur0；

31、cua＝ks×cua0；

32、ccr＝ks×ccr0；

33、其中，cur0，cua0，ccr0为尿酸，尿素及肌酐经过标准曲线计算得到的初始浓度。

34、另一方面，本发明还提供一种基于肾功三联检测测试卡的校准系统，该系统包括：

35、所述测试卡包括三个检测单元和校准检测单元，三个检测单元包括：尿素检测单元、尿酸检测单元、肌酐检测单元，所述校准检测单元用于样本内血清含量测量，根据样本信号值反馈的hct含量，对尿素检测单元、尿酸检测单元、肌酐检测单元的测试结果分别进行校准，所述校准系统包括：

36、曲线获取模块，用于获取尿素检测单元、尿酸检测单元、肌酐检测单元中尿素、尿酸和肌酐在不同反应阶段对应的信号曲线；

37、初始浓度计算模块，用于根据尿素、尿酸在检测中的标准曲线，得到对应的初始浓度cur0，cua0；

38、获取肌酐检测单元对应的双波长反应曲线，从而构建初始浓度计算方程，得到对应的初始浓度ccr0；

39、校准系数计算模块，用于获取校准检测单元中的hct值，进而计算实际血清占比，并根据实际血清占比，得到对应的校准系数；

40、浓度计算模块，用于根据校准系数获取校准后尿素，尿酸及肌酐全血测量最终浓度cur，cua，ccr。

41、最后，本发明还提供一种肾功三联检测测试卡，所述测试卡应用在上述的方法和系统上，该测试卡包括配合组装的上盖板和下盖板，上盖板设置在下盖板上，上盖板上开设有加样孔，下盖板之间的空间内设置有对应的四个显色反应层，显色反应层分别为尿素显色反应层、尿酸显色反应层、肌酐显色反应层和与校准显色反应层。

42、底板固定在下盖板上，底板从下至上依次放置显色反应层、反应辅助层、样本过滤层、样本扩散层，各个层位固定制成试纸条，将测试条、上下盖板配合组装成一种可抗干扰的肾功三联检测测试卡；

43、在加样孔内加入样本，样本通过样本扩散层均匀的扩散到样本过滤层，通过样本过滤层过滤分离样本血细胞以及部分蛋白，样本和反应辅助层进行反应，反应所得的产物和显色反应层结合进行显色，通过仪器反射光的信号值并通过hct校准后计算尿酸、尿素、肌酐的浓度测试结果。

44、进一步的，包括：

45、所述显色反应层的制备过程为：

46、肌酐的显色液为0.02％-5％色原物质，0.02％-0.5％稳定剂，0.02％-0.5％粘度剂，0.02％-0.5％乳化剂；其中，色原物质为咪唑类、dtnb、dcip、toos、htba中的一种或几种，稳定剂为糖类或蛋白类稳定剂，粘度剂为羟丙基纤维素或明胶中的一种或多种，乳化剂为op系列的一种或多种；

47、尿酸的显色液为0.02％-5％色原物质，0.02％-0.5％稳定剂，0.02％-0.5％粘度剂，0.02％-0.5％乳化剂；其中，色原物质为咪唑类、dtnb、dcip、toos、htba中的一种或几种，稳定剂为糖类或蛋白类稳定剂，粘度剂为羟丙基纤维素或明胶中的一种或多种，乳化剂为op系列的一种或多种；

48、尿素的显色液为0.02％-0.5％显色物质，0.02％-2％金属耦合剂，0.02％-10％粘度剂，0.02％-1％乳化剂，其中，色原物质为溴甲酚绿、溴百里酚蓝中的一种或几种，稳定剂为糖类或蛋白类稳定剂，粘度剂为羟丙基纤维素或明胶中的一种或多种，乳化剂为op系列的一种或多种；

49、hct校准位显色反应液为0.02％-0.5％血细胞破坏物质，2-20g/l血红蛋白反应物质；其中，血细胞破坏物质为表面活性剂，血红蛋白反应物质为叠氮钠、op-10、氰化物、十二烷基苯磺酸钠、硝酸盐类中的任意一种；

50、将上述反应液喷涂于膜材，37°烘箱烘干，制备得反应层。

51、进一步的，包括：

52、所述反应辅助层的制备过程包括：

53、肌酐反应试剂包括缓冲体系、肌酐酶、肌酸水解酶、肌酐氧化酶、过氧化物酶、稳定剂、抗干扰物质，其中，缓冲体系是磷酸盐缓冲液、tris缓冲液或者good，s缓冲液，浓度为0.05m-1.0m，反应ph在6.5-8.0；肌酐酶的浓度为50-150u/ml，肌酸水解酶的浓度为50-150u/ml，肌酐氧化酶的浓度为50-150u/ml，过氧化物酶溶度为200-1000u/ml；稳定剂为糖类或蛋白类稳定剂，在体系中的浓度为0.5％-2％；抗干扰物质为胆红素氧化酶、抗坏血酸氧化酶中的一种或种浓度为5-50u/ml；

54、尿酸反应试剂包括缓冲体系、尿酸酶、过氧化物酶、色原、稳定剂、抗干扰物质，其中缓冲体系是磷酸盐缓冲液、tris缓冲液或者good，s缓冲液，浓度为0.05m-1.0m，反应ph在6.5-8.0；尿酸酶的浓度为50-150u/ml，过氧化物酶溶度为200-1000u/ml；稳定剂为糖类或蛋白类稳定剂，在体系中的浓度为0.5％-2％；抗干扰物质为胆红素氧化酶、抗坏血酸氧化酶中的一种或种浓度为5-50u/ml；

55、尿素反应试剂包括缓冲体系、尿酸酶、过氧化物酶、色原、稳定剂、抗干扰物质，其中缓冲体系是磷酸盐缓冲液、tris缓冲液或者good，s缓冲液，浓度为0.05m-1.0m，反应ph在6.5-8.0；尿酸酶的浓度为50-150u/ml，过氧化物酶溶度为200-1000u/ml；色原是单一组分或者两种组分的色原物质，浓度为0.02％-0.5％；稳定剂为糖类或蛋白类稳定剂，在体系中的浓度为0.5％-2％；抗干扰物质为胆红素氧化酶、抗坏血酸氧化酶中的一种或种浓度为5-50u/ml。

56、进一步的，包括：

57、所述反应辅助层的制备过程还包括：

58、将肌酐反应液浸润辅助膜后在37°条件下烘干制备成肌酐反应辅助层；将尿酸底物液浸润辅助膜后在37°条件下烘干制备成尿酸辅助层；将尿素底物液浸润辅助膜后在37°条件下烘干制备成尿素辅助层。

59、有益效果：本发明提出一种肾功3联测试卡，可去除红细胞比容的干扰，同时进行人外周血、血清、血浆尿素，尿酸及肌酐定量测量，测量时间小于4min。该测试卡用于提高肾功3项测量准确性、便携性、简易性，为基层医疗及家庭肾功异常患者康复监测提供新的测量依据；

60、本发明采用的4孔3项目测试卡，配备校准位，且尿素位于最上端，依次为尿酸，肌酐及校准位，因此，采用肾功尿素，尿酸，肌酐项目测量纠正同体积全血样本不同血清含量带来的计算误差，更精确；

61、本发明采用的肌酐双波长多参数计算方法，降低了内源肌酸干扰和高浓度样本波长漂移误差，实现肌酐快速的高精度测量。