一种对双抗生产重组细胞株进行高通量错配检测的方法与流程

本发明涉及抗体检测，具体涉及一种对双抗生产重组细胞株进行高通量错配检测的方法。

背景技术：

1、双特异性抗体(bispecific antibody，bsab)简称双抗，具有两条抗原结合臂，可以结合两个不同的抗原靶点，或相同靶点的不同表位。双特异性抗体可用于研制抗肿瘤，抗自身免疫性疾病以及抗病毒的新一代药物。双抗的“knob in hole”结构是基于在抗体链的ch3区域用一个较大的氨基酸替换一个较小的氨基酸，形成一个“knob”结构，同时在另一条链上以较小的氨基酸替换多个较大的氨基酸形成一个“hole”结构，改变了fc的局部空间结构。杵臼结构设计有利于两种异源抗体重链的正确装配。以“knob inhole”为基础进行fab或fc改造而成，可增加scfv或纳米抗体，从而达到双抗或多抗靶向及治疗效果。

2、双特异性抗体药物的研发中，如何生产双抗是研发人员关注的问题。目前最广泛使用的方法是在两种不同的细胞系中表达单特异性单抗，分离并随后在体外组合，但这种方法成本高且获得双抗的难度大。另外还有一种方法是将两种单抗在一个细胞内进行共表达。细胞株表达双抗体系的优势在于采用细胞株表达体系，体内装配，纯化目的蛋白，能够极大的降低生产成本，降低细胞株筛选的工作量，缩短筛选周期。但这种方式的主要问题是形成目标双抗的同时，由于轻链和重链的随机结合，还会形成多种非目标双抗的变种。而对于如何快速、高效检测细胞株中双抗蛋白的错配行业内目前暂无可参考的方法。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明开发了一种有效区分kappa、lambda半抗表达的elisa及facs检测方法，从而有效检测双功能抗体中各半抗的表达水平，从而筛选半抗表达一致，即具有结构正确的双功能抗体，是一种在双抗生产细胞筛选阶段即可检测双抗错配情况的新方法。

2、本发明公开了一种对双抗生产重组细胞株进行高通量错配检测的方法，包括以下步骤(1)和/或步骤(2)：

3、(1)elisa方法：

4、s1、固定一抗，加入对待测细胞进行培养获得的上清，孵育；

5、s2、取s1的产物，向其中加入带有识别标记的抗kappa轻链二抗，继续孵育；

6、s3、取s1的产物，向其中加入带有识别标记的抗lambda轻链二抗，继续孵育；

7、s4、分别检测s2和s3产物中的识别标记信号，根据待测样本中kappa轻链和lambda轻链比例，判断是否存在错配；

8、(2)facs方法：

9、s01、对待测细胞进行前处理，获取含有双抗的待测样本；

10、s02、向所述待测样本中加入带有第一识别标记的抗kappa轻链二抗和带有第二识别标记的抗lambda轻链二抗，继续孵育；

11、s03、分别检测识别标记信号，根据待测样本中kappa轻链和lambda轻链比例，判断是否存在错配；

12、所述待测细胞为异源表达双抗编码基因的重组细胞。

13、进一步地，所述一抗为igg抗体，该一抗可与抗igg抗体的fc段结合。

14、进一步地，通过elisa方法检测胞外是否存在错配，通过facs方法检测胞内是否存在错配。

15、进一步地，在步骤(1)中，所述方法中还包括对双抗fc段含量的检测，如加入带识别标记的抗fc二抗与s1的产物进行孵育，检测识别标记的信号。

16、进一步地，在步骤(1)中，若要从大量细胞中筛选出含有较少错配物的候选细胞，计算odkappa与odfc的比值以及odlambda与odfc的比值，选择odkappa/odfc>80％且odlambda/odfc>50％的细胞株。

17、进一步地，在步骤(2)中，若要从大量细胞中筛选出含有较少错配物的候选细胞，计算同时被第一识别标记与第二识别标记所标记的细胞占比，选择占比较高的细胞株。进一步地，在步骤(1)中，所述识别标记可为能识别的酶，包括但不限于辣根过氧化物酶，相应地，检测识别标记信号时，需加入显色底物进行反应。

18、进一步地，在步骤(2)中，识别标记的信号可为荧光信号，且第一识别标记与第二识别标记的荧光信号不同，如第一识别标记与第二识别标记选自fitc、fam、tet、pe、cy3、cy5、dapi等中的两种。

19、进一步地，在步骤(1)中，二抗的工作浓度为：kappa二抗(hrp)的工作浓度为0.3-1μg/ml，lambda二抗(hrp)的工作浓度为0.25-1μg/ml。

20、进一步地，在步骤(2)中，二抗的工作浓度为：抗kappa轻链二抗的工作浓度为10-30μl/1×106cells；抗lambda轻链二抗的工作浓度为10-20μl/1×106cells。最优选地，kappa二抗(fitc)的最佳用量为10μl/1×106cells；lambda二抗(pe)的最佳用量为20μl/1×106cells。

21、进一步地，所述重组细胞的宿主细胞为任意可生产抗体的细胞，包括但不限于cho系列细胞等。

22、进一步地，所述双抗fc段(互补决定区ch3上)的重链和轻链含有knob-in-hole结构。

23、本发明的有益效果：

24、抗体的轻链(lc)根据其结构和恒定区抗原性的差异分为“kappa轻链”和“lambda轻链”，现有技术只能通过同一细胞不同结构的轻链含量预测正确装配概率，无法准确反馈正确装配比例，且未有相关报道给出能够支持大量细胞株筛选阶段判断双功能抗体结构正确的方法。本发明为提高表达双抗细胞筛选效率，并筛选具有结构正确的双功能抗体，通过不同结构lc表达量不同而筛选表达比例接近1：1的细胞株，提高正确表达、装配的细胞株筛选概率和效率。

技术特征：

1.一种对双抗生产重组细胞株进行高通量错配检测的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)和/或步骤(2)：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一抗为igg抗体。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过elisa方法检测胞外是否存在错配，通过facs方法检测胞内是否存在错配。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述方法中还包括对双抗fc段含量的检测，具体为加入带识别标记的抗fc二抗与s1的产物进行孵育，检测识别标记的信号。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，计算odkappa与odfc的比值以及odlambda与odfc的比值，选择odkappa/odfc>80％且odlambda/odfc>50％的细胞株。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，计算同时被第一识别标记与第二识别标记所标记的细胞占比，选择占比较高的细胞株。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述识别标记包括辣根过氧化物酶。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，识别标记的信号为荧光信号，且所述第一识别标记与第二识别标记的荧光信号不同。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，抗kappa轻链二抗的工作浓度为0.3-1μg/ml，抗lambda轻链二抗的工作浓度为0.25-1μg/ml。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，抗kappa轻链二抗的工作浓度为10-30μl/1×106cells；抗lambda轻链二抗的工作浓度为10-20μl/1×106cells。

技术总结本发明公开了一种对双抗生产重组细胞株进行高通量错配检测的方法。现有技术中未发现有针对双抗不同light chain进行检测，并应用于细胞株开发中的报道，本发明提供一种在双抗细胞筛选阶段即可检测双抗错配情况的方法。具体地，提取待测样本，检测双抗轻链中的Kappa轻链和Lambda轻链的含量，根据Kappa轻链和Lambda轻链的比例判断是否错配。本发明的方法能够筛选出半抗表达量一致的候选细胞，极大的提高了获得正确装配的候选细胞的概率，且不会额外增加工艺开发过程以及筛选过程的时间成本。技术研发人员：刘羽,潘亭如,王凤川受保护的技术使用者：北京华放天实生物制药有限责任公司技术研发日：技术公布日：2024/10/10