基于PRRSV二聚体N蛋白建立的量子点荧光微球抗体检测试纸及制备方法

本发明涉及一种基于prrsv二聚体n蛋白建立的量子点荧光微球抗体检测试纸及制备方法，属于免疫检测。

背景技术：

1、免疫层析技术(immunochromatography assay，ica)是出现于20世纪80年代初期的新型免疫学检测技术。ica操作简便、快速灵敏、成本低廉，现已广泛应用于病原抗体的大规模临床检测。量子点荧光微球是一种新型的纳米荧光标记材料，具有宽激发波长范围和窄发射波长范围。相对于传统荧光染料，量子点荧光微球具有更高的荧光强度，其灵敏度高、特异性强、稳定性好，现已成功应用于快速诊断领域。

2、猪繁殖与呼吸综合征(prrs)，俗称猪蓝耳病，是由prrs病毒(prrs virus，prrsv)感染引起的猪高度接触性传染疫病，可引起母猪发生繁殖障碍综合征及不同日龄猪群的呼吸系统疾病。当前，prrs是危害全球养猪业的主要传染病，对养猪业造成巨大经济损失，已成为制约我国养猪业高质量发展的重要因素。

3、prrsv基因组大小约为15.4kb，包含目前已发现的11个开放阅读框，编码16个非结构蛋白和8个结构蛋白。其中，核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，n)具有良好的免疫原性和免疫反应性。猪感染prrsv后首先产生针对n蛋白的非中和抗体，早期免疫反应在感染后1周就可以检测到，而且能够维持较长时间，n蛋白诱导机体产生的抗体能够维持到第105天，其抗体水平下降速度远低于基质蛋白(matrix protein，m)和囊膜糖蛋白(glycoproteins，gps)诱导产生的抗体。这些特性使n蛋白成为建立prrsv抗体检测方法以反映猪群prrsv感染情况的理想抗原。

4、截至目前，针对prrsv尚未有切实可靠的防控手段，因此对prrs进行及时准确的诊断和监测具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于prrsv二聚体n蛋白(n-dimer)建立的量子点荧光微球抗体检测试纸及制备方法，该试纸灵敏度高、结果可数据化，能够应用于临床以实现prrsv抗体的快速检测。

2、为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

3、一种基于prrsv二聚体n蛋白建立的量子点荧光微球抗体检测试纸，包括支撑板，支撑板上依次固定有样品垫、结合垫、层析检测膜和吸水垫；其中结合垫由玻璃纤维棉包被，固定有量子点荧光微球标记的prrsv二聚体n蛋白；层析检测膜为硝酸纤维素膜，其上设置有检测线和质控线，其中检测线上固定有葡萄球菌蛋白a、质控线上固定有抗prrsv二聚体n蛋白的多克隆抗体。

4、所述量子点荧光微球标记的prrsv二聚体n蛋白的制备方法为：取10μgprrsv二聚体n蛋白，加入100μl偶联缓冲液混匀；将稀释后的prrsv二聚体n蛋白加入到活化后的量子点荧光微球溶液中快速混匀，25℃混匀孵育2h；加入50μl封闭液，25℃混匀孵育2h；去除多余蛋白：封闭结束后，12000rpm离心15min，弃上清；加入100μl偶联缓冲液，超声均匀；12000rpm离心15min，弃上清；加入100μl偶联缓冲液超声重悬，4℃保存备用。

5、所述的量子点荧光微球的活化方法：取100μl量子点荧光微球加入500μl活化缓冲液；加入10μl n-羟基丁二酰亚胺-琥珀酰亚胺和5μl 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液，25℃混匀孵育活化30min；12000rpm离心15min，弃上清；加入500μl活化缓冲液，12000rpm离心15min，弃上清；加入400μl偶联缓冲液，完成活化。

6、所述量子点荧光微球为水溶性羧基化cdse/zns量子点荧光微球；活化缓冲液为浓度为50mm、ph 6.0的2-吗啉乙磺酸缓冲液；偶联缓冲液为浓度为50mm、ph 7.4的硼砂缓冲液。

7、所述prrsv二聚体n蛋白的制备方法：根据genbank：aow71959.1获取prrsvnadc30-like毒株hnhx的n蛋白基因序列，将(ggggs)3linker串联n蛋白基因序列；然后进行密码子优化并合成构建至原核表达载体pet-28a获得prrsv二聚体n蛋白的重组表达载体，命名为pet-28a-n-dimer；

8、将pet-28a-n-dimer转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，挑取单菌落至含有100μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37℃、220rpm培养至od600值为0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mm的异丙基硫代半乳糖苷，16℃诱导16h；12000rpm离心15min，弃去上清；按照20mmtris-hcl ph 8.2、20％甘油、150mm nacl配制平衡液，按照1:50加入配制好的平衡液重悬菌体沉淀；将重悬后的样品放置于冰浴中，进行超声破碎，超声5s间隔5s，共超声破碎30min；12000rpm离心10min，收集上清，利用镍离子螯合亲和层析法进行纯化：以含有250mm咪唑的缓冲液洗脱目的蛋白，分装后-80℃保存。

9、所述prrsv二聚体n蛋白的多克隆抗体制备方法为：

10、以prrsv二聚体n蛋白为免疫原，采用背部多点皮下注射的方式对10周龄的雄性新西兰实验兔进行免疫；首次免疫以弗氏完全佐剂与免疫原采用1:1的比例进行混合，免疫后第21天、42天采用弗氏不完全佐剂与抗原混合乳化后进行加强免疫；免疫后第56天，采用间接elisa检测方法测定血清抗体效价：稀释prrsv二聚体n蛋白至2.0μg/ml，包被于酶标板；将处理后血清作为一抗进行孵育，从1:1000开始进行梯度稀释，以免疫前制备的阴性血清作为对照；加入按1:20000稀释后的辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔igg作为二抗进行孵育；计算待测血清的od450值与阴性对照血清的od450值，并计算进行比值p/n，当待测血清的od450值接近1，且p/n＞2.1时，所得结果即为多克隆抗体效价；

11、当多克隆抗体效价达到1:100000以上时进行纯化：5ml血清中加入0.9g无水硫酸钠混匀；37℃静置2h后，10000rpm离心20min，弃上清；加入与血清等体积的pbs重悬后，用pbs透析四次，使用紫外分光光度计检测多克隆抗体的浓度，并进行分装标记。

12、所述的量子点荧光微球抗体检测试纸的制备方法包括以下步骤：

13、(1)层析检测膜的制备

14、将硝酸纤维素检测膜切成300×25mm的长条，置于喷点仪平台上，以1μl/cm的量喷涂浓度为1.0mg/ml的葡萄球菌蛋白a和以1μl/cm的量喷涂浓度为5.0mg/ml的兔抗prrsv二聚体n蛋白的多克隆抗体在硝酸纤维素膜上，形成检测线和质控线，42℃干燥4h，密封干燥保存；

15、(2)样品垫的制备

16、将玻璃纤维棉裁剪成300×15mm的长条，在含质量浓度为1％吐温-20的生理盐水的样品垫缓冲液中浸泡均匀；然后将样品垫平放在干燥架上，42℃干燥4h，密封干燥保存；

17、(3)结合垫的制备

18、将玻璃纤维棉裁剪成300×8mm的长条，平放在喷膜仪平台上；将量子点荧光微球标记的prrsv二聚体n蛋白以7μl/cm的用量喷涂于结合垫上，42℃干燥40min，密封干燥保存；

19、(4)吸水垫的制备

20、将吸水纸裁剪成2.5×30cm的长条，密封干燥保存；

21、(5)支撑板的制备

22、将双面胶贴于pvc支撑板，切成7.5×30cm的长板，制备支撑板；

23、(6)试纸的组装

24、将层析检测膜、样品垫、结合垫、吸水垫依次粘贴于支撑板上，各部分连接处有2mm重叠，用切割机切割成2.8×60mm的试纸条。

25、所述的量子点荧光微球抗体检测试纸在检测prrsv抗体中的应用。

26、所述的量子点荧光微球抗体检测试纸在制备prrsv抗体检测试剂中的应用。

27、所述的量子点荧光微球抗体检测试纸在prrsv流行病学调查中的应用。

28、本发明的有益效果：

29、1、本发明基于prrsv二聚体n蛋白(n-dimer)建立的量子点荧光微球抗体检测试纸，结合垫固定有量子点荧光微球标记的prrsv n-dimer；质控线上固定有抗prrsv n-dimer的多克隆抗体，以新型荧光标记材料水溶性羧基化cdse/zns量子点荧光微球作为示踪剂，利用免疫层析原理对血清中的prrsv抗体进行检测，能够应用于临床实现对prrsv抗体的快速检测。

30、2、本发明利用n蛋白在prrsv颗粒中以二聚体的形式存在，通过(ggggs)3linker将n蛋白基因序列串联，制备出稳定性高、免疫反应性好的prrsv n-dimer。

31、3、本发明选用prrsv n蛋白作为检测靶标，是由于n蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。猪感染prrsv后首先产生针对n蛋白的非中和抗体，早期免疫反应在感染后1周就可以检测到；而且n蛋白诱导机体产生的抗体能够维持较长时间。

32、4、本发明利用prrsv n-dimer建立的量子点荧光微球抗体检测试纸，灵敏度高、特异性好，并且均一性好、重复性佳、简便快捷，而且借助荧光免疫分析仪可直接读取数值实现检测结果量化，比基于prrsv单体n蛋白(n-monomer)建立的量子点荧光微球抗体检测试纸具有更高的灵敏性，能够适应基层临床大规模快速检测prrsv抗体的需要，为有效防控prrs提供重要的监测工具和技术支持。