一种对猪伪狂犬病病毒gD和/或gB蛋白的HPLC定量检测方法与流程

本发明涉及新材料，具体涉及一种对猪伪狂犬病病毒gd和/或gb蛋白的hplc定量检测方法。

背景技术：

1、伪狂犬病(pseudorabies，pr)是由伪狂犬病病毒(prv)引起的，可导致多种家畜和野生动物以发热、奇痒(猪除外)及脑髓炎为主要症状的急性传染病。猪是该病毒的中间宿主和传染源，不同生长阶段的猪均可感染并引起不同的临床症状，猪的伪狂犬病防控对于公共卫生学具有极其重要意义。目前，新发的伪狂犬病病毒变异株已经遍布我国主要养猪地区，传统的疫苗已经无法为免疫猪提供完全的保护。

2、目前已有几家公司陆续申报了猪伪狂犬病病毒基因工程亚单位疫苗，是应用cho细胞表达系统制备的新型疫苗，重组gb+gd蛋白可有效诱导机体产生抵御prv的感染。cho细胞表达的gb和gd蛋白经过纯化、灭活后，与免疫佐剂混合等一系列工艺制成，其特点是可避免母源抗体干扰，商品猪首免效果好，同时可鉴别疫苗免疫和野毒感染。

3、目前常规的定量方法有bca法、紫外吸收法、lowry法、elisa法等，bca、lowry与a280紫外吸收法只能检测样品中总蛋白的量，无法测定样品中目标蛋白的量，elisa法虽然特异性高，但都需要特异性单抗，原料要求高且干扰因素多，易受个人操作影响。

4、在现有技术中，大部分的检测方法只能单一的检测gb蛋白或gd蛋白；

5、如cn117402223a公开了一种牛疱疹病毒4型抗原、制备方法和应用，其采用凝胶过滤色谱柱tskgel g3000swxl，以20mm磷酸盐，200mm nacl，ph 6.8的流动相检测bhv-4gb蛋白样品。

6、cn113164585b公开了用于预防或治疗巨细胞病毒的先天性感染的疫苗，其采用pbs作为流动相，以流速0.4ml/分钟进行hplc凝胶过滤分析，检测gpcmv-gb。

7、目前，没有一个成熟的方法对gb蛋白和gd蛋白进行检测。

8、因此，需要一种能够快速、准确、重复性好的猪伪狂犬病病毒gb和gd蛋白hplc定性及定量检测方法。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于，提供一种对猪伪狂犬病病毒gd和/或gb蛋白的hplc定量检测方法，该方法选择分子尺寸排阻高效液相色谱柱，以加入有异丙醇的磷酸盐缓冲液为流动相，可以有效的分离和检测毒gd蛋白和gb蛋白，本发明的方法具有有效排除杂质干扰，出峰时间稳定，峰形两侧对称，定量准确，重复性好的优势。

2、本发明提供的技术方案如下：

3、一种对猪伪狂犬病病毒gd和/或gb蛋白的hplc定量检测方法，以添加有3～10vol％的异丙醇的磷酸盐缓冲液为流动相，采用分子尺寸排阻高效液相色谱柱，在流速为0.5～1.0ml/min；柱温为18～26℃的条件下，检测样品中的gd和/或gb蛋白的含量。

4、在上述的hplc定量检测方法中，所述磷酸盐缓冲液的ph为7.2～7.4。

5、在上述的hplc定量检测方法中，所述方法的检测波长为280nm。

6、在上述的hplc定量检测方法中，gb蛋白出峰时间为13.5～14.5min，gd蛋白出峰时间为17.5～18.5min。

7、在上述的hplc定量检测方法中，所述分子尺寸排阻高效液相色谱柱的分子量分离范围为10～500kda。

8、在上述的hplc定量检测方法中，所述分子尺寸排阻高效液相色谱柱的型号为biocore sec-300型号。

9、在上述的hplc定量检测方法中，所述样品在进样前，样品经过过滤、层析、分子筛脱盐处理。

10、在上述的hplc定量检测方法中，层析的具体操作为：

11、使用buffer1平衡5个柱体积，每次上样体积200ml，使用8vol％buffer2和92vol％buffer1淋洗10个柱体积，使用40vol％buffer2和60vol％的buffer1进行洗脱，收集洗脱液；

12、其中，buffer1含20mm nah2po4，500mm nacl，buffer1的ph为7.40；

13、buffer2含20mm nah2po4，500mm nacl，500mm咪唑，buffer2的ph为7.40。

14、有益效果

15、与现有技术相比，本发明通过色谱柱选择、流动相的优化，获得了猪伪狂犬病病毒gb或gd蛋白的单一目标峰，避免了杂峰干扰的检测方法，并且峰型对称性好。由hplc检测法的操作步骤可知，只有取样稀释存在人为操作误差，其余步骤均为仪器操作，故此方法简单，准确度高，重复性好。

技术特征：

1.一种对猪伪狂犬病病毒gd和/或gb蛋白的hplc定量检测方法，其特征在于，以添加有3～10vol％的异丙醇的磷酸盐缓冲液为流动相，采用分子尺寸排阻高效液相色谱柱，在流速为0.5～1.0ml/min；柱温为18～26℃的条件下，检测样品中的gd和/或gb蛋白的含量。

2.根据权利要求1所述的hplc定量检测方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的ph为7.2～7.4。

3.根据权利要求1所述的hplc定量检测方法，其特征在于，所述方法的检测波长为280nm。

4.根据权利要求1所述的hplc定量检测方法，其特征在于，gb蛋白出峰时间为13.5～14.5min，gd蛋白出峰时间为17.5～18.5min。

5.根据权利要求1所述的hplc定量检测方法，其特征在于，所述分子尺寸排阻高效液相色谱柱的分子量分离范围为10～500kda。

6.根据权利要求5所述的hplc定量检测方法，其特征在于，所述分子尺寸排阻高效液相色谱柱的型号为biocore sec-300型号。

7.根据权利要求1所述的hplc定量检测方法，其特征在于，所述样品在进样前，样品经过过滤、层析、分子筛脱盐处理。

8.根据权利要求7所述的hplc定量检测方法，其特征在于，层析的具体操作为：

技术总结本申请属于日化新材料领域，公开了一种对猪伪狂犬病病毒gD或gB蛋白的HPLC定量检测方法，以添加有3～10vol％的异丙醇的磷酸盐缓冲液为流动相，采用分子尺寸排阻高效液相色谱柱，在流速为0.5～1.0ml/min；柱温为18～26℃的条件下，检测样品中的gD和/或gB蛋白的含量。该方法选择分子尺寸排阻高效液相色谱柱，以加入有异丙醇的磷酸盐缓冲液为流动相，可以有效的分离和检测猪伪狂犬病病毒gD蛋白和gB蛋白，本发明的方法具有有效排除杂质干扰，出峰时间稳定，峰形两侧对称，定量准确，重复性好的优势。技术研发人员：胡美容,齐冬梅,刘秋燕,胡换仪,陈杰涛,吴峰,赖月辉,曾洁香,李文静受保护的技术使用者：广东永顺生物制药股份有限公司技术研发日：技术公布日：2024/10/10