一种Fhb7突变体及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程，尤其涉及一种fhb7突变体及其应用。

背景技术：

1、小麦赤霉病(fusarium head blight，fhb)是由镰刀菌所引起的一种小麦真菌性疾病，由于其具有巨大的破坏力，因此被认为是世界范围内小麦和大麦最具毁灭性的真菌病害之一。在2020年9月，中国农业农村部也将小麦赤霉病列入《一类农作物病虫害名录》。近年来，气候的变化为粮食和饲料安全带来了许多意想不到和更频繁的生物压力。在这个气候变化的时代下，全球持续出现的温暖和潮湿天气状况为霉菌的生长提供了更加有利的条件，从而加剧了fhb的爆发，fhb的发生会带来严峻的食品安全问题。感染赤霉病的小麦中存在着多种霉菌毒素，这些霉菌毒素对于人类和动物的健康而言是巨大的威胁。因此，控制fhb和真菌毒素解毒是当前气候变化时代解决粮食问题具有重要意义的研究领域。

2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇，又名呕吐毒素(don)，是一种来自镰刀菌属的环氧倍半萜类次级代谢产物，属于单端孢霉烯族毒素家族，该类家族化合物的特点就在于c12/c13位的环氧基团，该基团已经被证实是这类化合物的主要致毒基团。此外，有研究证实don不仅是蛋白质合成的抑制剂，对人类和动物具有严重的细胞毒性、免疫毒性、遗传毒性，而且还是fhb的基本致病因子，能够促进镰刀菌进一步侵染农作物。除了感染fhb的农作物原料会带来don污染以外，粮食在储藏、加工和运输过程中同样具有污染风险。由此可见，寻找don的降解方法不仅对于保障粮食安全具有重要意义，同时在构建能够抵抗fhb的抗性农作物方面同样具有重要的参考价值。

3、与低效、营养损失和不安全的化学和物理降解策略相比，生物方法因其安全、高效和生态友好而受到越来越多的关注。近年来，越来越多的生物讲解呕吐毒素的方法被报道。其中主要分为两种不同的类型，一是通过某些微生物对于呕吐毒素具有一定的物理吸附作用，通过将don吸附在微生物表面，从而实现解毒的目的。但是，这种物理吸附的方式效率低，并且存在着较大的安全问题。

4、二是通过微生物所产生的酶对don进行酶学转化，将其转化成毒性更低或者无毒的产物以达到最终的解毒目的。由于酶学转化的专一性、温和性、高效性，使其比仅仅通过物理吸收来解毒的微生物具有更好的实际应用价值。目前为止，虽然已经分离出许多能够降解don的微生物，但其中具体发挥功能的酶却报道较少。在已经报道的几种酶中，其对don的酶学转化都集中在c3位羟基和c9＝c10这两个基团上，例如在c3-oh上进行乙酰化、糖基化、差向异构化和氧化。但是，作为don中最致毒基团c12/c13环氧，在2020年以前尚未发现有酶能够针对这一关键基团对呕吐毒素进行解毒。因此发现能够开环氧的酶比针对3-oh和c9＝c10的酶具有更加深远的意义。由于环氧基团处在don的c12/c13处，而在这个位置上缺少活泼的基团来增强其反应性，因此通过酶学方法转化该环氧基团来达到解毒效果较为困难。在2020年之前，仅发现了一种肠道厌氧细菌能够针对呕吐毒素的环氧基团进行生物转化。研究者从牛瘤胃液中分离出的eubacterium sp.bbsh 797能够通过还原去环氧的方式将don转化为毒性很低的dom-1，并且这株菌已被作为工业饲料添加剂用于don解毒。

5、直到2020年，针对don的环氧基团的第一种酶fhb7被成功克隆，它是由一个小麦赤霉病抗性基因fhb7所编码的酶。fhb7属于谷胱甘肽-s转移酶(gst)超家族，利用谷胱甘肽(gsh)作为解毒剂催化打开don的环氧基团。虽然，作为意义最为深远的抗fhb基因，fhb7已经开始被用于小麦育种领域。然而，fhb7的热稳定性非常差，纯化出的蛋白在冰上孵育10分钟左右即开始沉淀并失去活性，fhb7的活性和稳定性严重阻碍了其在体外的实际应用价值，从而极大地限制了其作为呕吐毒素解毒酶在工业上发挥作用。

6、微生物的酶法脱毒虽然在实际应用中具备强大的优势，但是由于其常需要在体内发挥作用，而肠道内的环境对于多数酶而言是不利的，很容易造成酶活力的丧失。相比之下，微生物作为添加剂加入到饲料中，通过微生物来进行毒素解毒这一思想或许能够取得更好的效果。近年来，也有不少具有呕吐毒素降解功能的微生物从环境中被分离出来，但是因为这些微生物本身的解毒效率、生物安全性等方面都极大地限制了它们作为解毒微生物在实际中的应用。合成生物学技术的兴起，给这一领域带来了新的曙光。利用目前已经发现的解毒基因作为元件，选择生物安全已经得到证实的微生物作为底盘细胞，构建具备霉菌毒素解毒功能的工程菌，这或许能够很大程度上解决工业中霉菌毒素污染严重的问题。然而，针对这一领域的研究非常有限，所以尚未有成功的工程菌被应用于饲料脱毒。

技术实现思路

1、本发明提供了一种fhb7突变体以及该突变体在低成本、高效率地降解单端孢霉烯族毒素中的应用，解决了野生型小麦赤霉病抗性蛋白fhb7热稳定性差且活性不高的缺陷。

2、本发明的第一目的是提供一种fhb7突变体，其含有在seq id no.1所示的氨基酸序列中发生至少一项以下氨基酸替换后的序列：

3、(1)第29位的氨基酸缬氨酸val替换为脯氨酸pro；

4、(2)第77位的氨基酸天冬酰胺asn替换为酪氨酸tyr；

5、(3)第95位的氨基酸亮氨酸leu替换为苯丙氨酸phe；

6、(4)第5位的氨基酸苏氨酸thr替换为丝氨酸ser，且第29位的氨基酸缬氨酸val替换为脯氨酸pro，且第52位的氨基酸甲硫氨酸met替换为亮氨酸leu，且第77位的氨基酸天冬酰胺asn替换为酪氨酸tyr，且第95位的氨基酸亮氨酸leu替换为苯丙氨酸phe，且第176位的氨基酸天冬氨酸asp替换为谷氨酸glu，且第208位的氨基酸亮氨酸leu替换为苯丙氨酸phe，且第262位的氨基酸半胱氨酸cys替换为色氨酸trp，且第265位的氨基酸甘氨酸ala替换为甘氨酸gly，且第269位的氨基酸谷氨酰胺gln替换为精氨酸arg。

7、本发明通过蛋白质工程技术对野生型小麦赤霉病抗性蛋白fhb7进行改造，发现通过上述特定位置上的氨基酸替换能够使得fhb7突变体相比野生型fhb7具有更高的热稳定性和活性，能够使其作为解毒酶在工业中广泛应用。

8、本发明的野生型fhb7来源于长穗偃麦草中。

9、作为本发明的一种优选的fhb7突变体，具有：

10、(1)如seq id no.2所示的氨基酸序列；或

11、(2)与seq id no.2同源性为70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％，且具有同等活性的氨基酸序列。

12、本发明发现，在fhb7突变体中，具有上述氨基酸序列或与其同源性较高且具有相同活性的氨基酸序列时，fhb7突变体的热稳定性和活性更加优异。

13、在本发明中，与目标序列同源性较高的序列包括在目标序列的基础上进行氨基酸的取代、缺失、增加中的至少一种，但在满足上述同源性的同时也需要满足具有同等活性。

14、优选地，氨基酸的缺失是指30个氨基酸以内、更优选为10个氨基酸以内的缺失。

15、优选地，氨基酸的取代是指25个氨基酸以内、更优选为10个氨基酸以内的取代。

16、优选地，氨基酸的增加是指40个氨基酸以内、更优选为20个氨基酸以内的增加。

17、作为本发明的一种优选的fhb7突变体，具有：

18、(1)如seq id no.4所示的氨基酸序列；或

19、(2)与seq id no.4同源性为70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％，且具有同等活性的氨基酸序列。

20、本发明发现，在野生型蛋白fhb7的氨基酸序列中将第29位氨基酸v突变成p，获得的fhb7突变体具有比野生型更高的热稳定性和活性。

21、本发明的第二目的是提供编码上述任一fhb7突变体的核酸。

22、作为本发明的一种优选的核酸，具有：

23、(1)如seq id no.3所示的核苷酸序列；或

24、(2)seq id no.3所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；或

25、(3)在严格条件下可以与seq id no.3所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

26、作为本发明的一种优选的核酸，具有：

27、(1)如seq id no.5所示的核苷酸序列；或

28、(2)seq id no.5所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；或

29、(3)在严格条件下可以与seq id no.5所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

30、本发明的第三目的是提供含有上述任一fhb7突变体、或任一核酸的生物材料。

31、优选地，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌。

32、优选地，所述重组菌为重组大肠杆菌，更优选为重组k1系列大肠杆菌。

33、优选地，所述重组菌为重组酵母，更优选为重组毕赤酵母菌株。

34、优选地，本发明提供了含有上述任一fhb7突变体、或任一核酸的工程化枯草芽孢杆菌。

35、本发明的第四目的是提供上述任一fhb7突变体、或上述任一核酸、或上述任一生物材料在降解单端孢霉烯族毒素中的应用。

36、优选地，本发明提供上述任一fhb7突变体、或上述任一核酸、或上述任一生物材料在降解含有单端孢霉烯族毒素的材料中的应用。

37、所述材料包括但不限于饲料、小麦及其制品、玉米及其制品、谷物及其制品。

38、使用本发明的上述任一fhb7突变体、任一核酸、或任一生物材料作为生物催化剂，能够以谷胱甘肽(gsh)作为解毒剂，通过酶法打开单端孢霉烯族毒素的关键致毒基团c12/c13环氧基团，以实现单端孢霉烯族毒素的降解。图1为呕吐毒素降解机理图。

39、在降解单端孢霉烯族毒素时，优选地，单端孢霉烯族毒素的初始浓度为0.01～1mm，更优选为0.01～0.1mm。优选地，谷胱甘肽的初始浓度为1～10mm，更优选为0.2～2mm。优选地，反应条件为ph值4～10，温度10℃～50℃，更优选30℃。优选地，在搅拌下进行反应0.1～2h。

40、使用微生物作为宿主的情况下，只要可以稳定地保持在菌体内，作为载体可以使用市售的任一种质粒。使用大肠杆菌作为宿主的情况下，优选使用pet28a、pqlinkhx质粒。

41、在具体实施过程中，通过将获得的基因(dna片段)连接于特定的启动子序列的下游，可在大肠杆菌中诱导表达产生大量目的蛋白。例如，pet28a具有可表达诱导的t7启动子，通过在培养的中途将异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)添加入培养基，可以使大肠杆菌表达出fhb7蛋白或者其突变体。

42、转化体的培养通过通常的方法实施。即，若以芽孢杆菌属或大肠杆菌类的细菌时，培养基可以使用肉汤培养基、lb培养基(1％胰胨、0.5％酵母提取物、0.5％食盐)或myt培养基(1.6％胰胨、酵母提取物、0.5％食盐)等，可以在该培养基中接种菌株后，在37℃下根据需要一边搅拌一边培养4-8小时，随后向其中加入0.1～1mm iptg，在16～20℃下根据需要一边搅拌一边培养12～20小时，将得到的培养液离心分离，回收微生物菌体。

43、进一步，可以将上述微生物菌体通过机械破坏(采用旋转搅拌机、弗氏压碎器、匀浆器、研钵等)、冻结溶解、自我消化、干燥(采用冷冻干燥、风干等)、酶处理(采用溶菌酶等)、超声波处理、化学处理(采用酸、碱处理等)等公知的方法进行破碎，把得到的菌体的破碎物或者菌体的细胞壁或细胞膜的变性物等菌体处理物作为粗酶液进行单端孢霉烯族毒素的降解。

44、此外，也可以根据情况从上述菌体处理物中通过通常的酶纯化方法(盐析处理、等电点沉淀处理、有机溶剂沉淀处理、透析处理、各种层析法处理等)纯化具有单端孢霉烯族毒素降解活性的组分，制成部分纯化酶或纯化酶使用。

45、添加于反应体系中的酶只要具有所需的活性，可以是任意的形态，具体可以是微生物的菌体(包括转化体)、该菌体的处理物或由该处理物得到的酶等。

46、作为本发明的一种优选的实施方案，所述的单端孢霉烯族毒素为含有环氧基团的单端孢霉烯族毒素。

47、作为本发明的一种优选的实施方案，所述的单端孢霉烯族毒素为呕吐毒素、15-酰基化呕吐毒素、t-2毒素、niv、das中的至少一种。

48、本发明的第五目的是提供上述任一fhb7突变体、或上述任一核酸、或上述任一生物材料在以下至少一方面的应用：

49、(1)小麦赤霉病抗性农作物育种；

50、(2)构建可降解单端孢霉烯族毒素的微生物；

51、(3)用于临床及医药领域针对呕吐毒素及其类似物的解毒剂的制备；

52、(4)农作物中防治能够产生呕吐毒素及其类似物的微生物污染；

53、(5)开发粮食及饲料在贮藏和运输过程中能够产生呕吐毒素及其类似物的病原菌的抑菌剂；

54、(6)开发饲料添加剂。

55、优选地，应用(2)中所述微生物为工程菌；

56、所述工程菌包括但不限于芽孢杆菌属、酵母菌、乳杆菌属、链球菌属、以及其他被允许用于饲料工业或者医药行业的有益菌。

57、通过合成生物学原理可将本发明的上述任一fhb7突变体、或任一核酸、或任一生物材料作为元件用于小麦赤霉病抗性农作物育种中或用于构建可降解单端孢霉烯族毒素的有益工程菌。

58、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

59、本发明提供了一种fhb7突变体，具有优异的热稳定性和活性。而且其具有广谱的底物适应性，能够高效地利用gsh作为底物，催化破坏单端孢霉烯族毒素中关键致毒基团，以降低毒素毒性。本发明提供的fhb7突变体及其衍生物可作为基因元件或解毒剂，在饲料领域、生物医药领域以及农作物育种领域中发挥重要的脱毒作用，具有广阔的应用前景。