技术新讯 > 有机化合物处理,合成应用技术 > 用于体内合成3'SL和6'SL的新型唾液酸转移酶的制作方法  >  正文

用于体内合成3'SL和6'SL的新型唾液酸转移酶的制作方法

  • 国知局
  • 2024-10-21 14:19:21

本公开涉及唾液酸化人乳寡糖(hmo)的生产,特别是3’-唾液酸乳糖(3’sl)和6’-唾液酸乳糖(6’sl)的生产,以及包含用于所述生产的具有双重α-2,3-唾液酸转移酶/α-2,6-唾液酸转移酶活性的唾液酸转移酶的遗传工程细胞。

背景技术:

1、设计和建造用于生产唾液酸化人乳寡糖(hmo)的细菌细胞工厂,尤其是生产唾液酸化人乳寡糖(hmo)的混合物,对于为未来更复杂的产品提供创新且可扩展的解决方案至关重要。

2、为此,合理的菌株工程原理通常应用于单个细菌细胞。这些原理通常指a)向宿主引入所需的生物合成途径,b)增加所需反应中作为供体所需的相关活性糖的细胞池,c)通过天然乳糖通透酶lacy增强乳糖的输入,和d)引入合适的糖基转移酶以促进唾液酸化寡糖的生物合成生产(有关综述,请参阅bych等人2019年,current opinion in biotechnology56:130-137)。

3、wo2007/101862公开了使用例如来自空肠弯曲菌(c.jejuni)菌株的具有α-2,3α-2,8-唾液酸转移酶活性的唾液酸转移酶cstii与neubca基因表达相结合以产生cmp-neu5ac来生产唾液酸化hmo。然而,没有公开cstii产生3’sl和6’sl的组合。wo2019/020707和wo2019/118829中介绍了生产唾液酸化hmo的进一步尝试,其中描述了能够同时产生3’sl和6’sl的唾液酸转移酶,其中3’sl是次要副产物。

4、生产多种唾液酸化hmo的混合物使生产更加复杂,因为它通常需要表达多种唾液酸转移酶,这进一步挑战了生产菌株的生长和产量。

5、总之,为了生产唾液酸化hmo的混合物,能够在给定底物上唾液酸化多个位置的唾液酸转移酶将是有利的,并且可以获得能够生产两种或更多种唾液酸化hmo的可扩展生产平台。

技术实现思路

1、本公开涉及一种遗传修饰细胞,其包含编码具有双重α-2,3-唾液酸转移酶和α-2,6-唾液酸转移酶活性的酶(即,能够产生两种或更多种唾液酸化hmo,特别是3’sl和6’sl的α-2,3/6-唾液酸转移酶)的重组核酸序列。

2、本公开涉及所述遗传修饰细胞用于唾液酸化hmo混合物的生物合成生产的用途,所述遗传修饰细胞包含具有双重活性的唾液酸转移酶(即,作用于底物上多个位置的唾液酸转移酶)。

3、一组唾液酸转移酶以多种方式作用于底物的能力是一种特别强大的菌株工程工具,因为经修饰以表达单个异源唾液酸转移酶的细胞可以在单个发酵过程中产生多种唾液酸化hmo产物。具体而言,本公开的α-2,3/6-唾液酸转移酶能够产生3’sl和6’sl的混合物,其中两者的含量均超过所产生的总hmo的20%。此外,避免了酶竞争相同底物而产生的代谢负担。

4、与多酶方法相比,单酶菌株解决方案具有很大的优势,能够大规模生产唾液酸化hmo混合物,从而实现整体更稳定的生长和更高的产物产量。

5、具体而言,本公开涉及一种遗传修饰细胞,其包含编码具有双重α-2,3-唾液酸转移酶/α-2,6-唾液酸转移酶活性的酶的重组核酸序列,其中所述酶为选自以下的唾液酸转移酶:chepa,其包含seq id no:1的氨基酸序列或与seq id no:1具有至少80%、例如至少85%、例如至少90%、例如至少95%同一性的氨基酸序列,或由其组成;cinf1,其包含seqid no:2的氨基酸序列或与seq id no:2具有至少80%、例如至少85%、例如至少90%、例如至少95%同一性的氨基酸序列,或由其组成;ccol2,其包含seq id no:3的氨基酸序列或与seq id no:3具有至少80%、例如至少85%、例如至少90%、例如至少95%同一性的氨基酸序列,或由其组成;cjej1,其包含seq id no:4的氨基酸序列或与seq id no:4具有至少80%、例如至少85%、例如至少90%、例如至少95%同一性的氨基酸序列,或由其组成;poral2,其包含seq id no:5的氨基酸序列或与seq id no:5具有至少80%、例如至少85%、例如至少90%、例如至少95%同一性的氨基酸序列,或由其组成;和cstii,其包含seq idno:6的氨基酸序列或与seq id no:6具有至少80%、例如至少85%、例如至少90%、例如至少95%同一性的氨基酸序列,或由其组成;并且其中所述细胞产生3’sl和6’sl。

6、根据本公开的遗传修饰细胞可以进一步包含控制重组核酸表达的启动子元件,所述重组核酸编码具有α-2,3-唾液酸转移酶和α-2,6-唾液酸转移酶活性的酶。唾液酸转移酶可以例如受选自pglpf、pglpa_70utr、pglpt_70utr、plac、pmglb_70utr、及其变体的启动子的控制,所述启动子具有选自seq id no 17-40的核酸序列。优选地,唾液酸转移酶分别受选自seq id no 17、19、20、21、22、23、24、24、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36的重组启动子的控制。

7、根据本公开的遗传修饰细胞还可以包含编码能够将唾液酸化hmo输出到细胞外培养基中的mfs转运蛋白的核酸序列。优选地,mfs转运蛋白是nec或yberc或fred蛋白,其氨基酸序列分别根据seq id no:14或15或16。

8、根据本公开的遗传修饰细胞可以包含用于制造唾液酸糖核苷酸,例如cmp-neu5ac的生物合成途径。所述唾液酸糖核苷酸途径可以由编码来自空肠弯曲菌(campylobacterjejuni)的neubca的核酸序列(seq id no:13)编码。编码neubca的核酸序列可以由带有neubca操纵子的高拷贝质粒编码。

9、根据本公开的遗传修饰细胞可以是微生物,例如细菌或真菌,其中所述真菌可以选自酵母细胞,例如komagataella属、克鲁维酵母属(kluyveromyces)、耶氏酵母属(yarrowia)、毕赤酵母属(pichia)、saccaromyces属、裂殖酵母属(schizosaccharomyces)或汉逊酵母属(hansenula)的酵母细胞,或选自aspargillus属、镰刀菌属(fusarium)或thricoderma属的丝状真菌,并且所述细菌可以选自示例性的大肠杆菌属(escherichiasp.)、芽孢杆菌属(bacillus sp.)、棒状杆菌属(corynebacterium sp.)、乳酸杆菌属(lactobacillus sp.)和弯曲杆菌属(campylobacter sp.)。因此,根据本公开的遗传修饰细胞可以是大肠杆菌。

10、根据本公开的遗传修饰细胞可用于生产唾液酸化hmo的混合物,特别是用于生产3’sl和6’sl的混合物。

11、因此,本公开还涉及一种生产至少两种不同的唾液酸化人乳寡糖(hmo)的方法,所述方法包括培养包含编码具有双重α-2,3-唾液酸转移酶/α-2,6-唾液酸转移酶活性的酶的重组核酸序列的遗传修饰细胞,其中所述酶选自chepa、cinf1、ccol2、cjej1、poral2和cstii,其中产生的唾液酸化人乳寡糖(hmo)是3’sl和6’sl。

12、此外,本公开还涉及编码具有双重α-2,3-唾液酸转移酶/α-2,6-唾液酸转移酶活性的酶的重组核酸序列,其中所述重组核酸序列选自:chepa,其包含seq id no:1的氨基酸序列或与seq id no:1具有至少80%、例如至少85%、例如至少90%、例如至少95%同一性的氨基酸序列,或由其组成;cinf1,其包含seq id no:2的氨基酸序列或与seq id no:2具有至少80%、例如至少85%、例如至少90%、例如至少95%同一性的氨基酸序列,或由其组成;ccol2,其包含seq id no:3的氨基酸序列或与seq id no:3具有至少80%、例如至少85%、例如至少90%、例如至少95%同一性的氨基酸序列,或由其组成;cjej1,其包含seqid no:4的氨基酸序列或与seq id no:4具有至少80%、例如至少85%、例如至少90%、例如至少95%同一性的氨基酸序列,或由其组成;poral2,其包含seq id no:5的氨基酸序列或与seq id no:5具有至少80%、例如至少85%、例如至少90%、例如至少95%同一性的氨基酸序列,或由其组成;和cstii,其包含seq id no:16的氨基酸序列或与seq id no:6具有至少80%、例如至少85%、例如至少90%、例如至少95%同一性的氨基酸序列,或由其组成;其中所述酶编码序列优选受启动子序列的控制,所述启动子例如选自pglpf、plac、pmglb_70utr、pglpa_70utr、pglpt_70utr(分别为seq id no:17、18、28、29、30)、及其如表2所示变体(seq id no:19-27和31-40)。优选地,唾液酸转移酶受选自seq id no 17、19、20、21、22、23、24、24、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36的强重组启动子的控制。特别地,编码cstii的核酸序列受选自分别具有根据seq id no:17、28、29、30的核酸序列的pglpf、pmglb_70utr、pglpa_70utr和pglpt_70utr的启动子,或其变体的控制,如表2中公开。所述核酸构建体通常用于宿主细胞中以生产至少两种不同的唾液酸化hmo,例如3’sl和6’sl。下文将参考相关附图和序列描述各种示例性实施方式和细节。应注意的是,附图仅旨在方便描述实施方式。它们并非旨在作为对本公开的详尽描述或对本公开范围的限制。此外,所示实施方式不需要具有所示的所有方面或优点。结合特定实施方式描述的方面或优点不一定限于该实施方式,并且可以在任何其他实施方式中实施,即使没有如此示出或没有如此明确地描述。

本文地址:https://www.jishuxx.com/zhuanli/20241021/317712.html

版权声明:本文内容由互联网用户自发贡献,该文观点仅代表作者本人。本站仅提供信息存储空间服务,不拥有所有权,不承担相关法律责任。如发现本站有涉嫌抄袭侵权/违法违规的内容, 请发送邮件至 YYfuon@163.com 举报,一经查实,本站将立刻删除。