乳酸菌、乳酸菌组合物、乳酸菌的制造方法、乳酸菌的耐酸性提高方法、乳酸菌的筛选方法及发酵乳的制造方法与流程

本发明涉及乳酸菌、乳酸菌组合物、乳酸菌的制造方法、乳酸菌的耐酸性提高方法、乳酸菌的筛选方法及发酵乳的制造方法，更详细而言，涉及提供乳酸菌及含有其的乳酸菌组合物、乳酸菌的制造方法、乳酸菌的耐酸性提高方法、乳酸菌的筛选方法以及使用这些乳酸菌和/或乳酸菌组合物的发酵乳的制造方法。

背景技术：

1、乳酸菌是自古以来被用于制造酸奶等发酵乳、泡菜等发酵食品的微生物，近年来，作为给宿主带来基于消化道内菌群调节的整肠效果、免疫功能改善效果及抗肿瘤效果之类的各种有益效果的益生菌而备受关注。

2、但是，现有的乳酸菌通常耐酸性差，例如经口摄取的乳酸菌的肠道内存活率会由于胃酸、胆汁酸之类的酸而降低，因此存在如下问题：乳酸菌不能在肠道内充分发挥上述作为益生菌的本来所具有的效果。因此，以往进行了一些以提高乳酸菌的耐酸性为目的的研究。例如，日本特开2005-160号公报(专利文献1)记载了通过破坏包括乳酸菌在内的微生物的hrca基因来提高微生物在人及动物体内的存活性的方法。另外，例如日本特开2001-204468号公报(专利文献2)记载了以得到酸性条件下乳酸生产率也高的微生物为目标的包含重组载体的耐酸性产乳酸微生物，所述重组载体整合有来自属于双歧杆菌属或乳杆菌属的微生物的乳酸脱氢酶基因及启动子。

3、现有技术文献

4、专利文献

5、专利文献1：日本特开2005-160号公报

6、专利文献2：日本特开2001-204468号公报

技术实现思路

1、发明要解决的问题

2、但是，关于与乳酸菌的耐酸性有关的因子，报道的数量并不充分。因此，例如作为乳酸菌是否具有优异的耐酸性的试验，以往会进行人工胃液耐受性试验(in vitro)、利用动物进行消化道通过性试验，但是这些方法也具有难以一次性对大量的乳酸菌种进行试验的问题。因此，期望对与乳酸菌的耐酸性有关的因子进行进一步研究。

3、本发明是鉴于上述现有技术所具有的课题而作出的，目的在于，提供对胃酸等酸的耐受性足够优异的乳酸菌及含有其的乳酸菌组合物、对酸的耐受性提高的乳酸菌的制造方法、乳酸菌的耐酸性提高方法、对酸的耐受性足够优异的乳酸菌的筛选方法、以及使用这些乳酸菌和/或乳酸菌组合物的发酵乳的制造方法。

4、用于解决问题的方案

5、本发明人们为了实现上述目的进行了深入研究，成功地分离出在耐酸性试验中显示高存活率的乳酸菌。接着，为了探索乳酸菌中的与耐酸性有关的因子，在上述耐酸性试验中存活率高的乳酸菌(高耐酸性乳酸菌)与以往的普通的乳酸菌(即，耐酸性试验中存活率低的乳酸菌：低耐酸性乳酸菌)之间进行了基因组分析。在该基因组分析中，作为高耐酸性乳酸菌所共有的、伴有氨基酸突变的突变，提取出kup基因中的移码突变、无义突变。进而，将上述高耐酸性乳酸菌多次传代而诱发突变时，得到失去耐酸性的乳酸菌，因此在其与上述高耐酸性乳酸菌之间也进行了基因组分析。其结果是，在失去耐酸性的乳酸菌中，所诱发的突变导致上述高耐酸性乳酸菌中提取出的kup基因中的移码突变、无义突变消失，基本回复到原低耐酸性乳酸菌的kup基因的核苷酸序列。

6、由此，本发明人们根据这些见解发现，kup基因是与乳酸菌的耐酸性有关的因子，该kup基因的功能被抑制的乳酸菌对酸的耐受性足够优异。由此还发现，通过人为地抑制kup基因的功能能够提高乳酸菌的耐酸性，以kup基因的功能受到抑制为指标能够容易地筛选对酸的耐受性足够优异的乳酸菌，从而完成了本发明。

7、因此，本发明提供下述方式。

8、[1]

9、一种乳酸菌的耐酸性提高方法，其包括人为地抑制乳酸菌的kup基因的功能的工序。

10、[2]

11、根据[1]所述的方法，其中，上述乳酸菌为乳杆菌科(lactobacillaceae)乳酸菌。

12、[3]

13、根据[1]或[2]所述的方法，其中，上述乳酸菌为乳杆菌属(lactobacillus)乳酸菌。

14、[4]

15、一种耐酸性提高的乳酸菌的制造方法，其包括人为地抑制乳酸菌的kup基因的功能的工序。

16、[5]

17、根据[4]所述的制造方法，其中，上述乳酸菌为乳杆菌科(lactobacillaceae)乳酸菌。

18、[6]

19、根据[4]或[5]所述的制造方法，其中，上述乳酸菌为乳杆菌属(lactobacillus)乳酸菌。

20、[7]

21、一种乳酸菌，其kup基因的功能受到抑制。

22、[8]

23、根据[7]所述的乳酸菌，其为乳杆菌科(lactobacillaceae)乳酸菌。

24、[9]

25、根据[7]或[8]所述的乳酸菌，其为乳杆菌属(lactobacillus)乳酸菌。

26、[10]

27、一种乳酸菌组合物，其含有[7]～[9]中任一项所述的乳酸菌。

28、[11]

29、根据[10]所述的乳酸菌组合物，其还含有链球菌属(streptococcus)乳酸菌。

30、[12]

31、根据[10]或[11]所述的乳酸菌组合物，其为乳酸菌发酵剂。

32、[13]

33、根据[10]或[11]所述的乳酸菌组合物，其为发酵乳。

34、[14]

35、一种高耐酸性乳酸菌的筛选方法，其包括选择工序，所述选择工序以kup基因的功能受到抑制为指标来选择乳酸菌。

36、[15]

37、一种发酵乳的制造方法，其包括发酵工序，所述发酵工序向含有原料乳的调制乳液体中添加选自由通过[4]～[6]中任一项制造方法得到的乳酸菌、[7]～[9]中任一项所述的乳酸菌、[10]～[13]中任一项所述的乳酸菌组合物及通过[14]的筛选方法选出的乳酸菌组成的组中的任意者而使其发酵，得到发酵乳。

38、[16]根据[15]所述的发酵乳的制造方法，其包括进一步向上述调制乳液体中添加链球菌属(streptococcus)乳酸菌的工序。

39、发明的效果

40、根据本发明，能够提供对胃酸等酸的耐受性足够优异的乳酸菌及含有其的乳酸菌组合物、对酸的耐受性提高的乳酸菌的制造方法、乳酸菌的耐酸性提高方法、对酸的耐受性足够优异的乳酸菌的筛选方法、以及使用这些乳酸菌和/或乳酸菌组合物的发酵乳的制造方法。

1.一种乳酸菌的耐酸性提高方法，其包括人为地抑制乳酸菌的kup基因的功能的工序。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述乳酸菌为乳杆菌科(lactobacillaceae)乳酸菌。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述乳酸菌为乳杆菌属(lactobacillus)乳酸菌。

4.一种耐酸性提高的乳酸菌的制造方法，其包括人为地抑制乳酸菌的kup基因的功能的工序。

5.根据权利要求4所述的制造方法，其中，所述乳酸菌为乳杆菌科(lactobacillaceae)乳酸菌。

6.根据权利要求4所述的制造方法，其中，所述乳酸菌为乳杆菌属(lactobacillus)乳酸菌。

7.一种乳酸菌，其kup基因的功能受到抑制。

8.根据权利要求7所述的乳酸菌，其为乳杆菌科(lactobacillaceae)乳酸菌。

9.根据权利要求7所述的乳酸菌，其为乳杆菌属(lactobacillus)乳酸菌。

10.一种乳酸菌组合物，其含有权利要求7所述的乳酸菌。

11.根据权利要求10所述的乳酸菌组合物，其还含有链球菌属(streptococcus)乳酸菌。

12.根据权利要求10所述的乳酸菌组合物，其为乳酸菌发酵剂。

13.根据权利要求10所述的乳酸菌组合物，其为发酵乳。

14.一种高耐酸性乳酸菌的筛选方法，其包括选择工序，所述选择工序以kup基因的功能受到抑制为指标来选择乳酸菌。

15.一种发酵乳的制造方法，其包括发酵工序，所述发酵工序向含有原料乳的调制乳液体中添加选自由通过权利要求4～6中任一项的制造方法得到的乳酸菌、权利要求7～9中任一项所述的乳酸菌、权利要求10～13中任一项所述的乳酸菌组合物及通过权利要求14的筛选方法选择出的乳酸菌组成的组中的任意种而使其发酵，得到发酵乳。

16.根据权利要求15所述的发酵乳的制造方法，其包括向所述调制乳液体中进一步添加链球菌属(streptococcus)乳酸菌的工序。