包含IL-15变体的异二聚体多肽复合物及其用途的制作方法

总体来说，本技术涉及il-15蛋白和包含il-15蛋白的多肽复合物。更具体而言，本技术涉及il-15变体、融合蛋白、异二聚体il-15/il-15rα-fc多肽复合物、其制备方法及其用途。

背景技术：

1、重组促炎细胞因子(il-2、ifnα和tnfα等)已经获准用于癌症治疗数十年了，但其功效往往受到限制，主要是由于半衰期短和毒性。il-15是一种对于抗病毒和抗肿瘤免疫很重要的il-2家族促炎细胞因子，其参与许多免疫细胞(特别是溶细胞性t/nk细胞)的增殖和存活，而不会诱导免疫抑制性treg和t/nk细胞中的活化诱导的细胞死亡。基于il-15的疗法能够增强t/nk细胞，从而有益于抗肿瘤免疫并提高当前免疫疗法的治疗功效。

2、il-15在单核细胞和树突状细胞中产生，并且主要以与存在于相同细胞中的il-15受体α(il-15rα)形成的膜结合型异二聚体复合物的形式呈递。其作用通过将il-15/il-15rα复合物反式呈递给表达il-2rβ和共同γ链的nk细胞和t细胞来实现。

3、已经在多种临床试验中测试了il-15及其变体。然而，其在癌症免疫治疗中的潜力仍然因其免疫毒性和半衰期短而受到极大限制。仍然需要开发新型il-15变体、缀合物、融合蛋白和多肽复合物以提高治疗功效。

4、本公开提供了il-15变体和相应的异二聚体多肽复合物，其具有降低的毒性和增强的pk/pd谱。这些肽和复合物可以作为具有更高抗肿瘤功效的新型免疫治疗剂，特别是与其他治疗方案相结合用于治疗。

技术实现思路

0、发明概述

1、本公开提供了这些和其他目的，从广义上讲，本公开涉及提供具有改进功效的蛋白质的化合物、方法、组合物和制品。本公开提供的有益效果广泛适用于治疗学和诊断学领域，并且可以与和多种靶标反应的抗体结合使用。

2、在一些方面，本公开提供了一种il-15变体肽，其中与野生型il-15相比，该il-15变体肽在刺激免疫细胞增殖(诸如nk和/或cd8+t细胞增殖)方面具有更低的效力，并且与seq id no:1相比，其包含从n末端、c末端或同时从n末端和c末端截短1-30个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个)氨基酸的氨基酸序列。

3、在一些实施方案中，il-15变体肽由seq id no:1的截短体组成，其从c末端、n末端或同时从n末端和c末端截短1-12个氨基酸。在一些实施方案中，il-15变体肽从seq id no:1的c末端截短1-12个氨基酸(更优选1-5个氨基酸)。在一些实施方案中，il-15变体肽从seqid no:1的n末端截短1-12个氨基酸。在一些实施方案中，il-15变体肽由同时从c末端和n末端截短的seq id no:1的截短体组成，并且截短的氨基酸的总数目为2-12。

4、在一些实施方案中，il-15变体肽包含seq id no:51-69中任一项的氨基酸序列。举例来说，il-15变体肽可以由seq id no:51的氨基酸序列组成。

5、在一些实施方案中，il-15变体肽在刺激免疫细胞如nk细胞、dc细胞和t细胞的增殖和活化方面具有降低的效力(即，保留刺激能力但处于降低的水平)。所述免疫细胞不限于人类免疫细胞，并且还可以来源于其他物种，例如小鼠、大鼠和食蟹猴。

6、在一些实施方案中，如在通过facs的增殖和活化测定中所测量的，与野生型il-15相比，本文公开的il-15变体肽在刺激nk和/或cd8+t细胞增殖方面的效力降低了超过10倍、超过50倍、超过100倍、超过200倍、超过300倍、超过400倍、超过500倍、超过600倍、超过700倍、超过800倍、超过900倍、超过1000倍、超过1500倍、超过2000倍或甚至更多倍。增殖和活化测定可以使用ki-67和/或pstat5等作为标志物或指示物。

7、在一些方面，本公开提供了一种融合蛋白，其包含与非il-15部分可操作地连接的如本文公开的il-15变体。该非il-15部分可以是增加融合蛋白体内半衰期的部分，诸如选自peg、脂质、fc区、人血清白蛋白(hsa)和抗hsa部分的部分。在一些实施方案中，该非il-15部分是fc区，诸如人野生型igg1fc、igg2 fc、igg3 fc、igg4 fc或其变体。该非il-15部分也可以是il-15rα结构域。在一些实施方案中，il-15rα结构域包含以下或由以下组成：野生型il-15rα蛋白、保留il-15结合活性的il-15rα变体或其任何片段，诸如seq id no:2所示的片段。

8、在一些实施方案中，il-15变体肽与非il-15部分直接连接，或者经由接头如肽接头与非il-15部分间接连接，这种肽接头包括gs接头，诸如(g4s)n，其中n＝1-10(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。

9、在一些方面，本公开提供了一种多肽复合物，其包含il-15变体结构域、il-15rα结构域、第一二聚化结构域和第二二聚化结构域，其中：

10、该il-15变体结构域包括如上所述的il-15变体肽，即与野生型il-15相比在刺激免疫细胞(诸如nk和/或cd8+t细胞)的增殖或活化方面具有降低的效力，并且包含与seq idno:1相比从c末端、n末端或同时从n末端和c末端截短1-30个(例如1-12个)氨基酸的氨基酸序列；

11、所述第一二聚化结构域和第二二聚化结构域缔合在一起以形成二聚体。

12、在一些实施方案中，如本文公开的多肽复合物与包含野生型il-15而非il-15变体的相应多肽复合物相比，在刺激免疫细胞(诸如nk和/或cd8+t细胞)的增殖或活化方面具有降低的效力。

13、在一些实施方案中，包含在多肽复合物中的il-15变体肽包含seq id no:51-69中任一项，特别是seq id no:51的氨基酸序列。

14、在一些实施方案中，所述多肽复合物的il-15rα结构域包含以下或由以下组成：野生型il-15rα蛋白、保留il-15结合活性的il-15rα变体或其任何片段，诸如seq id no:2所示的片段。il-15rα结构域可以与il-15变体结构域在同一条链上，也可以在不同的链上。

15、在一些实施方案中，所述多肽复合物包含两条链，其中，从n末端到c末端：

16、第一链包含与第一二聚化结构域可操作地连接的il-15变体结构域；以及

17、第二链包含与第二二聚化结构域可操作地连接的il-15rα结构域。

18、在一些实施方案中，所述多肽复合物包含一个或多个靶向部分，诸如抗原结合部分。抗原结合部分可以位于二聚化结构域的n末端或c末端。抗原结合部分可以采用vhh、fab、scfv(单链可变片段)、vh或vl形式。

19、在一些实施方案中，所述多肽复合物包含两个抗原结合部分，其中第一抗原结合部分可操作地连接至第一二聚化结构域，并且第二抗原结合部分可操作地连接至第二二聚化结构域。

20、如本文公开的抗原结合部分可以特异性结合多种抗原，包括但不限于pd-1、pd-l1、pd-l2、ctla-4、lag3、tim-3、tim4、4-1bb、ox-40、ox-40l、gitr、a2ar、tigit、cd96、pvrig、cd226、5t4、vista、vsig3、vsig4、icos、cd28、cd3、cd4、cd8、cd45、cd44v6、cd27、cd47、sirpaα、slamf7、cd24、siglec10、siglec15、siglec8、vsir、vsig4、psgl-1、c5ar1、btn1a1、btn3a1、cd70、rankl、csf1r、csf2rb、tnfrsf1/1a/1b、bdca2、btla、c5ar、nkg2a、nkg2d、nkp30、nkp46、cd16a、cd56、cd166、fcgr3、cd2、神经纤毛蛋白(neuropilin)-1、ccr8、ccr2、ccr4、ccr5、ccr6、ccr7、ccr8、gcgr、cxcr2、cxcr4、cxcr5、calcrl、etar、glp1r、cx3cr1、gpr1、gpr17、gpr20、gpr30、gpr34、gpr-65、gpcr78、gprc5d、gpr84、lgr4、lgr5、vegf、vegfr、her2、her3、trop2、pcad、erα、egfr、de2-7 egfr、egfrviii、psma、psca、psa、tag-72、sez6、sez6l、sez6l2、sema4d、dll3、gd2、gpc3、klb、klrb1、klrg1、gpc1、pcsk9、epcam、p-钙粘蛋白、密封蛋白6、密封蛋白18.2、fgfr2b、fgfr3、fgfr4、muc1、muc13、muc16、muc17、mucl3、folra、tfr、tf、tfr、tfpi、c-met、ny-eso-1、gucy2c、liv-1、整联蛋白αvβ6、整联蛋白α10β1、整联蛋白α3、整联蛋白α5β4、整联蛋白αvβ3、整联蛋白αvβ8、ror1、ror2、prlr、ptk7、b7-h3、链接蛋白-4(nectin-4)、netg1、ax1、cd147、lrrc15、napi2b、steap1、ly6g6d、lypd1、macro、mertk、mica、micb、msln、mkars、g12d、cdh3、cdh6、cdh17、apla2、caix、cd46、cd47、cldn6、epha3、岩藻糖基-gm1、itga3、激肽释放酶、misrii、足萼糖蛋白(podocalyxin)、ron、robo1、pauf、pla2、足萼糖蛋白、prlr、ptk7、tm4sf1、tmeff2、treakr、trem-1、trem-2、uparap、tyrp1、kaag1、ru2as、cd146、cd63、内皮糖蛋白、globo h、igf-1r、tem1、tem8、tax1bp3、adam-9、enpp3、epha2、epha3、fcrh5、napi3b、tweak、dlk1、sort1、sstr2、steap1、cd25、cd39、garp、lrrc33、lair1、lamp3、lap、lepr、lilrb1、lilrb2、lilrb4、rage、fgl1、tpbg、pdgfrb、tgfbr2、ceacam1、ceacam5、ceacam6、癌胚抗原(cea)、icam1、a33、campath-1(cdw52)、碳酸酐酶ix(mn/ca ix)、cd248、pdpn、itgb1、itgav、cd20、cd19、cd21、cd22、cll、bcma、dclk1、ddr1、dlk1、dpep3、dkk1、cd5、cd13、cd30、cd33、cd34、cd36、cd37、cd38、cd43、cd52、cd55、cd94、cd99、cd7、cd71、cd73、cd74、cd79a、cd79b、cd229、cd132、cd133、g250、csf1r(cd115)、hla-dr、hla-g、htra1、tra-1-60、igfr、il-2受体、mcsp(黑色素瘤相关细胞表面硫酸软骨素蛋白聚糖)、art1、asgr1、b7h3、b7-h4、b7h6、cd124、c-kit(cd117)、cd7、clex12a、clever-1、il-13ra2、il-11ra、il-31ra、il-4ra、ifnar、actriib、il-7r、slamf7、fms样酪氨酸激酶3(flt-3,cd135)、gfra1、btla、globoh、csf2rb、硫酸软骨素蛋白聚糖4(cspg4，硫酸软骨素蛋白聚糖4)、itga4、clec5a、clec7a、clec9a、clec12a、clec14、cd205、cd206、cd200r1、cd228、cd229、cd40、cd40l、fcrn、tlr8、tlr9、tnfr2、ltbr、cd44、cd93、pdgf、pdgfr-α(cd140a)、pdgfr-β(cd140b)、cd146、cd147、crth2、tnf-α、tgf-β、il1racp、tslp、dr5、st2、成纤维细胞活化蛋白(fap)、cdcp1、derlin1、肌腱蛋白(tenascin)、卷曲受体1-10、血管抗原vegfr2(kdr/flk1)、vegfr3(flt4,cd309)、内皮糖蛋白、tie2和其他taa、i/o检查点、肿瘤微环境靶标或自身免疫性和炎症性疾病相关靶标。

21、在一些实施方案中，第一和第二抗原结合部分为vhh形式，并特异性结合pd-1。优选地，第一和第二抗原结合部分具有相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一和第二抗原结合部分包含如seq id no:80所示的氨基酸序列。

22、如本文提及的术语可操作地连接包括直接连接和经由接头如肽接头的连接。肽接头可以是部分或完整的igg铰链区。肽接头也可以是常规使用的肽接头，诸如gs系列接头，包括(gs)n、(g2s)n、(g3s)n、(g4s)n接头等。在一些实施方案中，二聚化结构域经由(g4s)n接头与抗原结合部分可操作地连接，其中n＝1-10。

23、在一些实施方案中，第一二聚化结构域是免疫球蛋白fc区的一条链，并且第二二聚化结构域是免疫球蛋白fc区的另一条链。fc区包括人igg fc，诸如人igg1 fc、igg2 fc、igg3 fc、igg4 fc或其变体。

24、在一些实施方案中，与野生型人fc相比，fc变体包含一个或多个置换以提高fc区的稳定性、促进异二聚化和/或改变与fc受体的结合。

25、在一些实施方案中，fc变体包括：

26、(a)人igg4 fc，其经工程化改造以包含以下一种或多种：s228p突变、f234a/l235a突变、m252y/s254t/t256e突变和“把手入孔”结构；或者

27、(b)人igg1 fc，其经工程化改造以包含以下一种或多种：m252y/s254t/t256e突变、g236r/l328r突变和“把手入孔”结构。

28、在一些实施方案中，所述fc变体包含：

29、(a)一条链的氨基酸序列与seq id no:3具有至少80％的同一性，并且另一条链的氨基酸序列与seq id no:4具有至少80％的同一性；

30、(b)一条链的氨基酸序列与seq id no:5具有至少80％的同一性，并且另一条链的氨基酸序列与seq id no:6具有至少80％的同一性；或者

31、(c)一条链的氨基酸序列与seq id no:7具有至少80％的同一性，并且另一条链的氨基酸序列与seq id no:8具有至少80％的同一性。

32、在一些实施方案中，多肽复合物的第一条链包含如seq id no:13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74或76所示的氨基酸序列，和/或多肽复合物的第二链包含如seq idno:14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、46、48、50、71、73、75或77所示的氨基酸序列。

33、在一些实施方案中，多肽复合物包含两条链，其中：

34、(a)第一链包含如seq id no:19所示的氨基酸序列，并且第二链包含如seq idno:20所示的氨基酸序列；

35、(b)第一链包含如seq id no:70所示的氨基酸序列，并且第二链包含如seq idno:71所示的氨基酸序列；

36、(c)第一链包含如seq id no:72所示的氨基酸序列，并且第二链包含如seq idno:73所示的氨基酸序列；

37、(d)第一链包含如seq id no:74所示的氨基酸序列，并且第二链包含如seq idno:75所示的氨基酸序列；

38、(e)第一链包含如seq id no:21所示的氨基酸序列，并且第二链包含如seq idno:22所示的氨基酸序列；

39、(f)第一链包含如seq id no:23所示的氨基酸序列，并且第二链包含如seq idno:24所示的氨基酸序列；

40、(g)第一链包含如seq id no:25所示的氨基酸序列，并且第二链包含如seq idno:26所示的氨基酸序列；或者

41、(h)第一链包含如seq id no:76所示的氨基酸序列，并且第二链包含如seq idno:77所示的氨基酸序列。

42、在一些方面，本公开提供了一种核酸分子，其包含编码如本文公开的多肽复合物的第一链和/或第二链、融合蛋白或il-15变体肽的核酸序列。

43、在一些方面，本公开提供了一种包含如本文公开的核酸分子的载体。在一些方面，本公开提供了一种包含如本文公开的载体或核酸分子的宿主细胞。

44、在一些方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含如本文公开的多肽复合物、融合蛋白或核酸分子，以及药学上可接受的载剂。

45、在一些方面，本公开提供了一种免疫缀合物，其包含与选自化学化合物(诸如细胞毒性剂、细胞生长抑制剂)、多肽、碳水化合物、脂质、核酸或其组合的部分缀合的如本文公开的多肽复合物或融合蛋白。

46、在一些方面，本公开提供了一种用于产生如本文公开的多肽复合物或融合蛋白的方法，其包括以下步骤：

47、-培养包含编码所述多肽复合物的一条或两条链或者所述融合蛋白的载体的宿主细胞；并且

48、-从宿主细胞培养物中分离多肽复合物或融合蛋白。

49、在一些方面，本公开提供了一种调节受试者中的免疫应答的方法，包括向受试者施用如本文公开的多肽复合物或药物组合物，任选地，所述免疫应答是nk细胞或t细胞(如cd8+t细胞)相关的。

50、在一些方面，本公开提供了一种用于治疗或预防受试者中的癌症、感染性疾病、免疫缺陷或淋巴细胞减少症的方法，包括向受试者施用有效量的如本文公开的多肽复合物或药物组合物。

51、在一些实施方案中，该方法进一步包括施用另外的抗肿瘤疗法，诸如细胞免疫疗法，包括肿瘤浸润性淋巴细胞(til)疗法、t细胞受体t细胞(tcr-t)疗法、嵌合抗原受体(car)t细胞疗法、nk细胞疗法，溶瘤病毒疗法，靶向疗法，化学疗法和基因疗法。另外的抗肿瘤疗法的施用可以在施用如本文公开的多肽复合物或药物组合物之前、之后或与其同时进行。

52、在一些方面，本公开提供了一种用于治疗或预防受试者中的癌症、感染性疾病、免疫缺陷或淋巴细胞减少症的方法，包括施用细胞疗法或基因疗法，其中所述细胞疗法和基因疗法包括将如本文公开的核酸分子递送至受试者。

53、在一些实施方案中，所述细胞疗法选自肿瘤浸润性淋巴细胞(til)疗法、t细胞受体(tcr)疗法、嵌合抗原受体(car)t细胞疗法和nk细胞疗法。在一些实施方案中，所述基因疗法使用慢病毒、aav、痘病毒、带状疱疹病毒、溶瘤病毒或其他rna/dna载体进行基因递送。

54、在一些实施方案中，癌症选自乳腺癌、肺癌(如nsclc)、结肠癌、卵巢癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾细胞癌、肝癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌、淋巴瘤(如非霍奇金淋巴瘤和弥漫性大b细胞淋巴瘤)、白血病(如慢性淋巴细胞白血病)和多发性骨髓瘤。

55、在一些实施方案中，感染性疾病是由病毒、细菌、真菌或寄生虫感染造成的。

56、在一些方面，本公开提供了如本文公开的多肽复合物、融合蛋白或核酸分子在制备用于预防、治疗和/或控制癌症、感染性疾病、免疫缺陷或淋巴细胞减少症的药物中的用途。

57、在一些方面，本公开提供了如本文公开的多肽复合物、融合蛋白或核酸分子用于治疗或预防癌症、感染性疾病、免疫缺陷或淋巴细胞减少症。

58、在一些方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含含有如本文公开的多肽复合物、融合蛋白或核酸分子的容器。

59、上述内容是一个概述，因此必然包含对细节的简化、概括和省略；所以，本领域技术人员将会理解，该概述仅仅是说明性的，而并非意在以任何方式进行限制。本文所述的方法、组合物和/或装置和/或其他主题的其他方面、特征和有益效果将在本文阐述的教导中变得显而易见。