重组微生物及其在制备L-草铵膦中的应用的制作方法

本发明属于生物合成领域，具体涉及一种重组微生物及其在制备l-草铵膦中的应用。

背景技术：

1、草铵膦(glufosinate)又称草丁膦(phosphinothricin)简称ppt，化学名称为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸，由赫斯特公司(现归属拜耳公司)开发生产属膦酸类除草剂，是世界第二大转基因作物耐受除草剂。

2、草铵膦有两种光学异构体，分别为l-草铵膦和d-草铵膦。但只有l型具有生理活性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。而市售草铵膦多为消旋草铵膦，不仅增加了使用量，而且造成了d-草铵膦的浪费。由此可见，l-草铵膦的制备技术开发尤为重要。

3、目前合成l-草铵膦的主要方法有化学法和生物法。化学法合成l-草铵膦通常步骤冗长，合成路线复杂，收率低，且手性拆分试剂昂贵。生物催化法制备l-草铵膦的方法目前大多是以2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸(ppo)为底物，经氨化反应，不对称合成l-草铵膦。

4、如专利cn111621482b中公开了一种草铵膦脱氢酶突变体、基因工程菌及一锅法多酶同步定向进化方法。此专利对草铵膦脱氢酶和葡萄糖脱氢酶以及之间的基因表达调控元件同时进行易错pcr，筛选活力提高菌株，从而筛选到高活性的草铵膦脱氢酶突变体和葡萄糖脱氢酶突变体。也对甲酸脱氢酶进行定点饱和突变筛选到了一个高活性的甲酸脱氢酶突变体。应用包含草铵膦脱氢酶突变体和葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶突变体的基因工程菌催化ppo制备草铵膦，其催化转化效率高，转化率＞99％，e.e.99％。但是此方法中以ppo为反应底物，ppo的价格较高，导致l-草铵膦的生产成本较高。

5、另有以d,l-草铵膦为原料制备l-草铵膦的方法，如us9834802b2中发明了以d,l-草铵膦为原料，在d-氨基酸氧化酶突变体(离体)的催化作用下生成中间产物ppo，ppo在氨基酸转氨酶的催化作用下生成l-草铵膦。该方法反应得到的组合物含l-草铵膦、d-草铵膦、ppo，其中l-草铵膦含量达到80％以上，d-草铵膦的含量小于10％、ppo含量小于20％。但是我们发现此酶催化的方法中，第一步反应生产的h2o2会破坏反应中酶的活性，降低了酶的催化效率。

6、

7、因此需要寻找一种更高效的l-草铵膦的生产方法。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中以d,l-草铵膦为原料酶催化制备l-草铵膦过程中酶活损失，催化效率低的缺陷，提供了一种重组微生物及其在制备l-草铵膦中的应用。使用本发明的重组微生物制备l-草铵膦的方法，能提高酶活稳定性，l-草铵膦的产率高，提高了生产效率，降低了生产成本。

2、本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。

3、本发明的第一方面提供一种重组微生物，所述重组微生物包含外源基因，所述外源基因包含d氨基酸氧化酶、过氧化氢酶、氨基酸脱氢酶和辅酶再生酶的基因；所述辅酶再生酶为用于还原态辅酶再生的酶。

4、本发明一些实施方案中，所述d氨基酸氧化酶包含如seq id no:1所示的氨基酸序列或其变体。

5、本发明一些实施方案中，所述过氧化氢酶为来源于酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)的过氧化氢酶，优选为ncbi登录号a6zv70对应的过氧化氢酶或其变体，其变体例如为seq id no:5所示的氨基酸序列。

6、本发明一些实施方案中，所述氨基酸脱氢酶为谷氨酸脱氢酶，优选为包含如seqid no:3所示的氨基酸序列或其变体。

7、本发明中，所述辅酶再生酶可为本领域常规用于还原态辅酶再生的酶，优选选自葡萄糖脱氢酶、醇脱氢酶、甲酸脱氢酶和氢化酶。

8、本发明中，所述重组微生物的微生物可为本领域常规，例如细菌或真菌；所述细菌优选为大肠杆菌或枯草芽孢杆菌，所述真菌优选为酵母。

9、本发明中，所述变体为将氨基酸序列上对应催化活性结构域至少一个、至少两个或至少三个位点进行保守氨基酸取代。

10、本领域技术人员应当理解，所述催化活性结构域为酶中具有结合和/或催化活性的功能域，参与构成催化活性结构域的氨基酸的变化(例如替换、缺失、取代等)，通常会导致酶的结合和/或催化活性的变化。

11、例如，所述d氨基酸氧化酶中，所述变体的氨基酸序列相对seq id no:1具有选自由w29g/h/i/n/q/k/y/c/l、v42c/d/e/h/p/y、e195h/n/q/y、c234l和v326w组成的组中的一种或多种突变；所述变体的氨基酸序列相对seq id no:1不单独具有w29k突变。在一些较佳实施方案中，所述变体的氨基酸序列相对seq id no:1具有以下任一突变：w29k、e195y和v42y；w29k、e195y和v326w；w29q、e195y和v42y；e195y和v42y；w29y、e195y和v42y；w29k、c234l和v42y；w29k、c234l和e195y；w29k、c234l和v326w；w29c、c234l和v42y；w29g、c234l和v42y；w29l、c234l和v42y；w29k、c234l、v326w和v42y；w29k、c234l、v42y和e195y；w29k、c234l、e195y和v326w。

12、例如，所述谷氨酸脱氢酶中，所述变体的氨基酸序列相对seq id no:3具有选自由g166e/c/a/t/h、a376v/g/p/s/e/q和t196v/s/c组成的组中的一种或多种突变；所述变体的氨基酸序列相对seq id no:3不同时具有g166a和a376v突变。在一些较佳实施方案中，所述变体的氨基酸序列相对seq id no:3具有以下任一突变：g166a；g166a和a376g；a376p；a376s和t196v；g166e和a376g；g166c；a376v；a376g；a376e；a376q；a376s和t196s；g166t和a376v；a376s；a376s和t196c；g166h和a376s。

13、本发明一些实施方案中，所述葡萄糖脱氢酶为来源于枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)的葡萄糖脱氢酶，优选为ncbi登录号afq56330.1对应的葡萄糖脱氢酶。

14、本发明一些实施方案中，所述醇脱氢酶为来源于短乳杆菌(lactobacillusbrevis)的醇脱氢酶，优选为ncbi登录号wp_011667141.1对应的醇脱氢酶。

15、本发明的第二方面提供一种重组微生物，所述重组微生物包含外源基因，所述外源基因包含d氨基酸氧化酶和过氧化氢酶；

16、所述d氨基酸氧化酶和过氧化氢酶如第一方面所述。

17、本发明的第三方面提供一种重组微生物，所述重组微生物包含外源基因，所述外源基因包含氨基酸脱氢酶和辅酶再生酶；

18、所述氨基酸脱氢酶和辅酶再生酶如第一方面所述。

19、本发明的第四方面提供一种重组微生物的组合，所述组合包括如第二方面所述的重组微生物和如第三方面所述的重组微生物。

20、本发明的第五方面提供一种酶组合，所述酶组合包括d氨基酸氧化酶、过氧化氢酶、谷氨酸脱氢酶和辅酶再生酶；

21、其中，所述d氨基酸氧化酶、过氧化氢酶、谷氨酸脱氢酶和辅酶再生酶如第一方面所述。

22、本发明的第六方面提供一种分离的核酸，所述核酸编码d氨基酸氧化酶、过氧化氢酶、氨基酸脱氢酶和辅酶再生酶中的至少两种酶；

23、所述d氨基酸氧化酶、过氧化氢酶、氨基酸脱氢酶和辅酶再生酶如第一方面所述。

24、本发明一些具体实施方案中，编码所述d氨基酸氧化酶的核苷酸序列包含如seqid no:2所示的核苷酸序列。

25、本发明一些具体实施方案中，编码所述过氧化氢酶的核苷酸序列包含如seq idno:6所示的核苷酸序列。

26、本发明一些实施方案中，所述氨基酸脱氢酶为谷氨酸脱氢酶，编码所述谷氨酸脱氢酶的核苷酸序列例如包含如seq id no:4所示的核苷酸序列。

27、本发明一些实施方案中，所述辅酶再生酶为醇脱氢酶和/或葡萄糖脱氢酶，编码所述醇脱氢酶的核苷酸序列例如包含如seq id no:7所示的核苷酸序列，编码所述葡萄糖脱氢酶的核苷酸序列例如包含如seq id no:8所示的核苷酸序列。

28、本发明的第七方面提供一种载体，所述载体包含：

29、(1)编码d氨基酸氧化酶的核酸和编码过氧化氢酶的核酸；和/或

30、(2)编码氨基酸脱氢酶的核酸和编码辅酶再生酶的核酸；

31、所述d氨基酸氧化酶、过氧化氢酶、氨基酸脱氢酶和辅酶再生酶如第一方面所述。

32、本发明一些实施方案中，编码所述d氨基酸氧化酶的核酸与编码所述氨基酸脱氢酶的核酸在相同或不同的载体上。

33、本发明的第八方面提供一种制备l-草铵膦的方法，所述方法包括以d型富集型草铵膦或消旋草铵膦为底物，在供氢体存在的条件下，将所述底物与如第一方面所述的重组微生物接触的步骤。

34、本发明的第九方面提供一种制备l-草铵膦的方法，所述方法包括以d型富集型草铵膦或消旋草铵膦为底物，在供氢体存在的条件下，将所述底物与如第四方面所述的重组微生物的组合接触的步骤。

35、本发明中，所述供氢体优选为所述重组微生物或重组微生物的组合中辅酶再生酶的催化底物。

36、本发明一些具体实施方案中，所述催化底物为葡萄糖，所述辅酶再生酶为葡萄糖脱氢酶。所述葡萄糖脱氢酶优选为来源于枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶，更优选地为ncbi登录号afq56330.1对应的葡萄糖脱氢酶。

37、本发明中，所述方法优选包含以下步骤：

38、(1)在培养基中培养所述重组微生物或所述的重组微生物的组合，并诱导外源基因表达；

39、(2)在所述培养基中加入所述底物和供氢体，继续培养；

40、(3)从步骤(2)所得培养液中获得l-草铵膦。

41、本发明一些实施方案中，步骤(2)中，所述底物浓度为50-500mmol/l。

42、本发明一些具体实施方案中，当催化底物为葡萄糖时，葡萄糖与底物的摩尔比为(0.5-2):1；例如为0.5:1、0.8:1、1:1、1.2:1、1.5:1、1.8:1、2:1。

43、本发明一些实施方案中，所述培养为有氧培养，温度为20～30℃，ph为6.5～8.0。

44、本发明一些较佳实施方案中，所述培养为有氧培养，温度为25～30℃，ph为7.5～8.0。

45、本发明中，所述方法优选包含以下步骤：

46、(1)在培养基中培养所述重组微生物或所述重组微生物的组合，并诱导外源基因表达；

47、(2)收集表达所述外源基因的菌体；任选地，收集后对菌体进行固定化，得到固定化菌体；

48、(3)在供氢体存在并通气的条件下，将步骤(2)所得菌体，任选地为固定化菌体，与底物溶液在辅酶存在的条件下接触反应，得到产物l-草铵膦。

49、本发明一些实施方案中，所述底物的溶液为质量浓度为5％-30％，例如为8％的水溶液。

50、本发明一些实施方案中，所述供氢体与底物的摩尔比为(0.5-2):1。

51、本发明一些实施方案中，辅酶由辅酶再生体系原位反应获得，所述辅酶再生体系包含氧化态辅酶、供氢体、辅酶再生酶，氧化态辅酶与底物的质量比为1：10-1：20000，例如1:10000。

52、本发明一些实施方案中，当所述重组微生物表达的辅酶再生酶为葡萄糖脱氢酶时，所述供氢体为葡萄糖；当所述重组微生物表达的辅酶再生酶为醇脱氢酶时，所述供氢体为异丙醇当所述重组微生物表达的辅酶再生酶为甲酸脱氢酶时，所述供氢体为甲酸铵；当所述重组微生物表达的辅酶再生酶为氢化酶时，所述供氢体为氢气。

53、本发明一些实施方案中，步骤(3)中所述通气的速率为0.5-1vvm，温度为25～35℃，ph为7.5～8.5。

54、本发明的第十方面提供一种胞外产物，所述胞外产物通过如第八方面或第九方面所述的方法制备获得。

55、本发明一些实施方案中，所述制备包括离心和/或从离心上清液中纯化产物。

56、本发明的第十一方面提供一种组合物，所述组合物包含l-草铵膦和2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸，所述l-草铵膦的含量为至少80％(m/m)，所述2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸的含量为至多3％(m/m)，所述d-草铵膦的含量为0～20％(m/m)；各组分含量以组合物中l-草铵膦、d-草铵膦和2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸的总量为100％计。

57、本发明一些实施方案中，所述组合物中，所述l-草铵膦的含量为至少90％(m/m)，所述2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸的含量为至多1.6％(m/m)；各组分含量以组合物中l-草铵膦、d-草铵膦和2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸的总量为100％计。

58、本发明一些较佳实施方案中，所述组合物中，所述l-草铵膦的含量为至少99％(m/m)，所述2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸的含量为至多0.5％(m/m)；各组分含量以组合物中l-草铵膦、d-草铵膦和2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸的总量为100％计。

59、本发明中所用草铵膦为草铵膦铵盐。

60、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

61、本发明所用试剂和原料均市售可得。

62、本发明的积极进步效果在于：

63、胞内催化与胞外催化相比，胞内催化的用酶量更低，可以在增加通气量的情况下提高反应速度，且酶保持较好的稳定性，能够实现重复套用；而胞外酶催化反应通气量增加后收率和转化率都会下降，反应体系有大量蛋白沉淀生成，酶活不稳定，且酶不能重复使用。此外，全细胞催化不需要菌体破壁提取酶，节省设备和操作步骤，提高生产效率。采用发酵法直接在发酵过程转化，葡萄糖既可以作为碳源，还可以作为供氢体，不需要加异丙醇等其它供氢体，并且节省了催化反应设备和反应时间，可以进一步提高生产效率，降低生产成本。