一种全细胞催化生产多巴胺的基因工程重组菌及其生产方法

本发明涉及生物，具体涉及一种全细胞催化生产多巴胺的基因工程重组菌及其生产方法。

背景技术：

1、多巴胺(dopamine)是最简单的儿茶酚胺类药物，其可激动交感神经系统肾上腺素受体和位于肾肾脏、肠系膜、冠状动脉、脑动脉的多巴胺受体。广泛用于急性心肌梗死、充血性心力衰竭、创伤、内毒素败血症、各类高危手术等引起的休克综合症，有效的提升了各类危急重症患者的生存率。多巴胺也是大脑中含量最丰富的儿茶酚胺类神经递质，多巴胺系统分泌及调节障碍会导致帕金森病、精神分裂症、tourette综合症、注意力缺陷多动综合症、垂体肿瘤等病症的发生。同时，多巴胺在一定条件下能够形成聚合物，作为新型的可降解生物相容性材料在生物医学等领域也有广泛应用。另外，在生物体内，以多巴胺为底物，经过β-羟化和n-甲基化修饰，可进一步合成另外两种临床应用广泛的儿茶酚胺类药物：去甲肾上腺素和肾上腺素。

2、根据目前研究报道，具有经济和应用价值的盐酸多巴胺原料药只能通过化学合成的方法获得。该合成方法具有多种缺点：(1)合成步骤繁琐，回收率低：其以香兰素为起始原料，经过缩合、还原和成盐等众多步骤后，多巴胺的收率仅为50％。(2)合成工序缺乏绿色环保：还原工序中以锌汞齐作还原剂，毒性大，制备难；去甲基工序中采用氢碘酸法制成多巴胺盐，氢碘酸具有很强的酸性及腐蚀性；反应过程中以甲醇作为溶剂，该试剂易燃易爆且毒性较大；(3)合成工序经济效益低：其原料香兰素价格较高，并且合成过程回收率低，进而造成多巴胺原料药价格昂贵，每吨原料药价格超过1000万人民币。

3、多巴胺生物合成报道少，研究浅。das等人(das a,verma a,mukherjee kj.synthesis of dopamine in e.coli using plasmid-based expression system andits marked eff ect on host growth profiles[j].preparative biochemistry andbiotechnology,2017,47(8):754-760.)在大肠杆菌dh5α中以质粒形式过表达4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶(hpabc)和来源于野猪(susscrofa)的左旋多巴脱羧酶(ssddc)，通过喂养底物酪氨酸，摇瓶培养24h，多巴胺产量仅为27mg/l。nakagawa等人(nakagawaa,matsuzaki c,matsumurae,et al.(r,s)-tetrahydropapaveroline production by stepwisefermentation using engineered escherichia coli[j].scientific reports,2014,4(1):6695.)在大肠杆菌bl21(de3)菌株中删除ty rr基因，通过pcoladuet-1和pet23a的双质粒过表达多巴胺合成途径关键基因tyrafbr、ar ogfbr、tkta、ppsa、rstyr和dodc，获得的工程菌株可以利用978mm甘油(90g/l)合成14mm(2.15g/l)多巴胺。kurt等人(kurt ag,aytane,ozer u,et al.production of l-dopaand dopamine in recombinant bacteriabearing the vitreoscilla hemoglobin gene[j].biotechnology journal:healthcarenutrition technology,2009,4(7):1077-1088.)在弗氏柠檬酸杆菌(citrobacterfreundii)和赫氏欧文氏菌(erwiniaherbicola)中表达来自于透明颤菌的血红蛋白增强氧气供应，通过喂养底物酪氨酸的方式培养24h，菌体内能够合成微量的多巴胺。lee等人(lee s,hong s,sung m.development of an enzymatic system for theproduction of dopamine from catechol,pyruvate,and ammonia[j].enzyme andmicrobial te chnology,1999,25(3-5):298-302.)组合使用纯化的酪氨酸苯酚裂解酶和酪氨酸脱羧酶为生物催化剂，以儿茶酚、丙酮酸和氯化铵为原料，催化10h得到8mm的多巴胺。

4、由此可见，利用微生物合成多巴胺的效率仍然较低，难以满足大规模工业化生产的要求。本发明公开的生产方法可以有效解决多巴胺合成效率低的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种高效全细胞催化生产多巴胺的方法及所用到的基因工程重组菌。

2、本发明提供一种用于全细胞催化生产多巴胺的基因工程重组菌，其特征在于，所述基因工程重组菌是通过在宿主细胞中表达脱羧酶基因而获得，优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌(escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)或需钠弧菌(vibrio natriegens)。

3、优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)或bl21(de3)plyss或rosetta(de3)或rosetta(de3)plyss或origami中的任意一种菌株作为宿主细胞。

4、另外优选地，所述脱羧酶基因的ncbi登录号为kaf6152535.1、aaa62346.1、aaa62347.1、aaa33860.1、aaa33109.1或aaa58437.1。

5、更具体地，所述脱羧酶基因的核苷酸序列如seq id no：1-6。

6、本发明提供一种构建用于全细胞催化生产多巴胺的基因工程重组菌的方法，其通过在出发宿主细胞中表达脱羧酶基因而获得所述基因工程重组菌。

7、具体实施方式中，所述脱羧酶基因连接至pet30a或pet28a或pet26b中任意一种表达载体上导入宿主细胞而实现表达；

8、本发明还提供一种催化生产多巴胺的全细胞催化剂，其是培养所述基因工程重组菌并表达脱羧酶基因，得到全细胞催化剂；具体地，利用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷或乳糖诱导脱羧酶基因表达，获得全细胞催化剂。

9、本发明提供一种全细胞催化生产多巴胺的方法，其采用所述的基因工程重组菌，或所述的全细胞催化剂，以左旋多巴作为底物，全细胞催化合成多巴胺。

10、在具体实施方式中，所述全细胞催化的体系中左旋多巴浓度为10-100g/l，全细胞催化剂用量为1-100od600；所述全细胞催化体系的反应体系为m9培养基、磷酸盐缓冲液、tris-hcl缓冲液、乙酸盐缓冲液中的任意一种。

11、优选地，所述反应体系的ph为5-8；反应温度为20-40℃；反应时间为0.5-24h；所述左旋多巴为纯品或者由微生物发酵获得的左旋多巴发酵液。

12、本发明的优点在于通过上述技术方案最终提供了一种将左旋多巴高效全细胞催化合成多巴胺的生产方法，利用一种脱羧酶的基因工程重组菌作为全细胞催化剂，将左旋多巴高效催化转化为多巴胺，整个催化过程中无需添加辅因子nadp+。本发明提供的全细胞催化生产多巴胺的方法具有合成效率高、无需添加辅因子、操作简单的特点，具有重要的工业应用价值。