一种用于高原头痛病辅助诊断的生物标志物及其试剂盒的制作方法

本发明属于分子生物检测，具体涉及一种用于高原头痛病辅助诊断的生物标志物及其试剂盒。

背景技术：

1、高原头痛病(high-altitude headache,hah)，又称高原性头痛或高海拔性头痛，根据国际头痛病学会(international headache society,ihs)定义，该病发生在长期生活于低海拔地区的平原人，在未适应新环境的情况下快速进入海拔2500米以上的高原后24小时内，表现为双侧额颞部轻度至中度的钝痛或压痛。地理学上把海拔高于500米，地势相对平坦或者有一定起伏的广阔地区叫高原，医学上将海拔高于2500米的地方叫高原。hah发病率较高，根据上升速度和具体海拔的不同，发病率高达25％至90％(luks,a.m.andp.h.hackett,medical conditions and high-altitude travel.《the new englandjournal of medicine》,2022.386(4):p.364-373)。该病危害性很大，不仅会严重影响急进高原人群的日常生活质量和降低其工作劳动能力，更严重的是，如果hah没有得到有效的控制与治疗，甚至可进展成为具有高致死率的高原肺水肿(high-altitude pulmonaryedema,hape)和高原脑水肿(high-altitude cerebral edema,hace)(pham,k.,k.parikhand e.c.heinrich,hypoxia and inflammation:insights from high-altitudephysiology.《frontiers in physiology》,2021.12:p.676782)。

2、尽管近年来对hah的诊断进行了大量的研究，现阶段国内外对hah的诊断主要依据患者所表现出的相关临床症状的强度和特征进行诊断。根据ihs制定的第二版《国际头痛分类标准》，诊断hah需符合以下4个条件：(1)进驻到海拔2500米以上高原；(2)头痛在到达高原后24小时内出现；(3)头痛在低转至较低海拔后8小时内逐渐缓解；(4)头痛性质至少符合以下5项中的2项：a.双侧头痛，b.头痛部位为额部或额颞部，c.疼痛性质为钝痛或压痛，d.疼痛强度为轻度至中度，e.头痛强度会因用力和头部或身体的运动而加重(headacheclassification subcommittee of the international headache society.theinternational classification of headache disorders:2nd edition.《cephalalgia》，2004.24suppl.1:9-160)。近年来随着《国际头痛分类标准》的更新，hah的诊断也进行了更新，依据ihs制定的第三版《国际头痛分类标准》，hah诊断需符合以下条件：(1)头痛符合标准3；(2)平原人上升至海拔超过2500m处，且至少符合下列3项中的2项：(a)头痛的发生与海拔上升在时间上相关，(b)符合下列2项中的1项或2项：a)头痛随海拔不断上升而明显加重，b)脱离高海拔环境24小时内即可缓解；(3)头痛至少符合下列3项中的2项：(a)双侧头痛，(b)轻至中度头痛，(c)用力、移动、拉伸、咳嗽和/或弯曲运动会加重头痛(headacheclassification committee of the international headache society(ihs).theinternational classification of headache disorders.3rd edition,《cephalalgia》，2018:1-211)。由于症状强度及症状特征存在较大的主观性，因此寻找更加可靠的客观性诊断指标成为hah诊断的又一研究热点。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供与一种用于高原头痛病辅助诊断的生物标志物，以及相关的应用和试剂盒，尤其是通过受检者唾液中hsa-mir-223-5p、hsa-mir-215-5p和hsa-mir-23b-3p的表达水平高低诊断高原头痛病的发病。

2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、1.检测样本中microrna表达量的试剂在制备高原头痛病的诊断工具中的应用，其特征在于，所述microrna为hsa-mir-223-5p、hsa-mir-215-5p和hsa-mir-23b-3p。

4、进一步，所述应用中hsa-mir-223-5p的序列如seq id no.1所示，所述hsa-mir-215-5p的序列如seq id no.2所示，所述hsa-mir-23b-3p的序列如seq id no.3所示。

5、进一步，所述工具包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台。

6、进一步，所述试剂盒包括针对microrna的引物和/或探针，所述芯片包括固相载体，以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于microrna的部分或全部序列；所述试纸包括针对microrna的引物和/或探针；所述高通量测序平台包括针对microrna的引物和/或探针。

7、进一步，所述引物包括检测microrna的逆转录引物、荧光定量反应的特异性正向引物以及特异性反向引物。

8、进一步，逆转录引物的序列如seq id no.5-seq id no.7所示。

9、7.一种高原头痛病的诊断试剂盒，所述试剂盒包含能够与各microrna分别特异性结合进行反转录的反转录引物，所述microrna为hsa-mir-223-5p、hsa-mir-215-5p和hsa-mir-23b-3p。

10、进一步，所述反转录引物序列如seq id no.5-seq id no.7所示。

11、进一步，还包括与反转录产物特异性结合并进行pcr扩增的引物。

12、进一步，所述引物包括正向引物和反向引物，正向引物序列如seq id no.9、seqidno.11、seq id no.13所示，反向引物序列如seq id no.10、seq id no.12、seq id no.14所示。

13、进一步，所述诊断试剂盒的microrna反转录反应体系中，按每10μl计，包括：反转录引物1μl，5x reverse transcription buffer 2μl，rtase mix 2μl，rnase-free h2o 3μl，其余2μl为样本rna。

14、进一步，所述诊断试剂盒rt反应温度参数：42℃60min，70℃10min。

15、进一步，所述诊断试剂盒还包括micrornaqpcr反应体系，所述micrornaqpcr反应体系按每20μl计包括：sybr green mix 10μl，mirnaforward primer 0.8μl，mirnareverseprimer 0.8μl，ddh2o 6.4μl，其余为rt反应产物2μl。

16、进一步，所述诊断试剂盒microrna qpcr反应条件为预变性95℃10min，变性95℃2s，退火60℃20s，延伸70℃10s。

17、本发明所要解决的技术问题是，找到一种或几种microrna标志物可以有效诊断出是否为hah患者。指导疾病精准治疗和防治，避免因hah疾病的延误而导致更多风险。

18、本发明解决上述问题的技术方案是：检测平原人急性进入高原后血浆或唾液中hsa-mir-223-5p、hsa-mir-215-5p和hsa-mir-23b-3p的表达量，以确定是否诊断为hah患者。

19、本发明的有益效果在于：本发明发现并用另一独立人群的急性暴露高原后唾液中循环microrna表达水平证实了血浆或唾液中循环hsa-mir-223-5p、hsa-mir-215-5p、hsa-mir-23b-3p或hsa-mir-222-3p等目标microrna表达水平和hah发病之间存在着相关性，其表达水平均上调，且p＜0.01，即有极显著统计学差异。可以将检测上述目标microrna的表达量作为制备诊断高原头痛病症的试剂或试剂盒应用，本发明的各目标microrna作为诊断hah病症的诊断效能都是很好的，其中hsa-mir-223-5p的诊断效能为0.802，hsa-mir-215-5p的诊断效能为0.780，hsa-mir-23-3p的诊断效能为0.853，以及hsa-mir-222-3p的诊断效能为0.868。进一步联合hsa-mir-222-3p和hsa-mir-23-3p的诊断效能为0.914；联合hsa-mir-223-5p、hsa-mir-215-5p和hsa-mir-23-3p的诊断效能更是高达0.940。

20、本发明提供的各目标循环microrna作为新型的生物标志物，具有稳定性好、灵敏性和特异性高的特点，新的分子标志物的开发利用将为高原头痛病的诊断以及进一步治疗提供新的方向。并且唾液样品易取得，具有无创性。研究证实了hsa-mir-223-5p、hsa-mir-215-5p、hsa-mir-23b-3p或hsa-mir-222-3p独立或者联合作为诊断高原头痛病的无创标记物的可靠性，诊断效能更为精准，可以客观性诊断急进高原人群是否为hah患者，对高原头痛病症的临床诊断和靶向治疗提供参考价值，从一定程度上避免了主观性人为判断的误差；精准指导疾病防治，减轻平原人进入高原后的疾病风险。