一种牙髓组织干细胞的分离制备方法及其牙髓组织清洗液与流程

本发明涉及牙髓组织处理，特别涉及一种牙髓组织干细胞的分离制备方法及其牙髓组织清洗液。

背景技术：

1、牙髓干细胞是来源于牙髓组织的成体干细胞，属于间充质干细胞，具有分裂增殖、多向分化、再生修复、自我更新功能，其在疾病治疗以及组织工程等领域中表现出重要的临床价值和应用前景。

2、牙髓干细胞(dental pulp stem cells，dpscs)作为一种间充质干细胞，不仅具有与其他间充质干细胞一样的良好增殖分化能力和多向分化潜能，同时无胚胎干细胞的致瘤性，并且来源丰富，取材过程中避免了对人体的二次创伤和伦理法律问题。

3、然而，现有的牙髓干细胞分离方法存在许多不足。牙齿位于口腔中，而口腔中的细菌种类繁杂，牙髓干细胞在分离制备及培养过程中极易污染，从而导致牙髓干细胞分离制备困难。当前在牙髓干细胞的分离制备中使用的牙髓清洗液大都为生理盐水或磷酸缓冲液，虽然配制简便，但不能有效解决染菌问题，也有采用加入抗生素的方法实现，但染菌的情况仍无法完全解决，不利于之后的干细胞分离和获取。

4、青霉素是抗菌素的一种，是指分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是由青霉菌中提炼出的抗生素。链霉素对许多革兰阴性杆菌如大肠埃希菌、克雷伯菌属、变形杆菌属、肠杆菌属、沙门菌属、志贺菌属、布鲁菌属、巴斯德杆菌属等也具抗菌作用；脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌亦对本品敏感。链霉素对葡萄球菌属及其他革兰阳性球菌的作用差。各组链球菌、铜绿假单胞菌和厌氧菌对本品耐药。

5、异噻唑啉酮主要由5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(cmi)和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(mi)组成。异噻唑啉酮是通过断开细菌和藻类蛋白质的键而起杀生作用的。异噻唑啉酮与微生物接触后，能迅速地不可逆地抑制其生长，从而导致微生物细胞的死亡，故对常见细菌、真菌、藻类等具有很强的抑制和杀灭作用。

技术实现思路

1、为了解决现有技术的问题，本发明提供了一种牙髓组织干细胞的分离制备方法及其牙髓组织清洗液，其能够降低牙髓干细胞分离制备过程染菌的风险，提高了牙髓干细胞的纯度和获得率。

2、本发明所采用的技术方案如下：

3、一种牙髓组织干细胞的分离制备方法，包括以下步骤：

4、a、牙齿的采集和保存：临床收集正常的乳牙或恒牙待用；

5、b、消毒清洗：将所述的牙齿用0.02％乙酸氯己定溶液浸泡消毒5-6min，随后将消毒后的牙齿用牙髓组织清洗液进行清洗；

6、c、分离：沿着牙釉质和牙骨质分界处用高速牙科手机环绕牙颈部磨出凹槽，不可穿髓，在超净化工作台中，沿凹槽劈开牙齿，取出牙冠根部的全部牙髓，并切除牙齿根尖部1mm的牙髓，将得到的牙髓用所述的牙髓组织清洗液清洗3-5次，将上述全部牙髓组织剪成1mm3～3mm3大小的牙髓块用以进行原代细胞培养；

7、d、消化：将所述的牙髓块移入牙髓干细胞组织消化液中，混匀后37℃消化15min，加入完全培养基终止消化后，离心，弃上清，将沉淀移入已加完全培养基的培养瓶中，于37℃、5％ co2恒温孵育箱内培养，24h后观察到细胞贴壁，每3d换液一次，2周左右待细胞爬满瓶底，约3-4d可传代1次，所述的组织消化液含有1:1比例混合的3mg/ml的ⅰ型胶原酶(collagenase typeⅰ)及4mg/ml分散酶(dispase)；

8、e、细胞传代：细胞融合度达80％～90％时，进行细胞消化弃掉培养瓶中的上清液，用生理盐水冲洗培养瓶底细胞，用0.25％try-edta的消化液消化细胞，待细胞由长梭形逐渐变圆并飘起时用新的无血清完全培养基终止消化；收集细胞并使之混匀，取样计数后离心；用无血清培养基重悬后并进行接种，培养3～4d时细胞融合度80％～90％进行细胞收获，经多次传代后即获得p1、p2、p3.......代细胞；收集第3-5代细胞可用于后续实验。

9、牙髓组织清洗液包括：生理盐水：100ml；青霉素：14mg～20mg；链霉素：14mg～20mg；异噻唑啉酮：8mg～10mg。

10、牙髓组织清洗液的制备方法包括：

11、(1)将青霉素，链霉素，异噻唑啉酮按照比例溶于生理盐水中，得到一份清洗液；

12、(2)将每份清洗液用125ml储液瓶分装，每瓶储液瓶存储100ml清洗液，之后拧紧瓶盖，用封口膜进行封口，装入自封袋后，再装入真空封口袋中，进行真空封口。、步骤(2)中，将所述的清洗液使用0.22μm滤器过滤得到过滤液；然后将过滤液稀释至1000ml得到二次清洗液；最后进行分装，每瓶100ml，分装、真空封口并低温保存。

13、步骤(1)(2)均需在无菌环境中操作。

14、本发明提供的技术方案带来的有益效果是：

15、(1)本发明所述的清洗液中加入了异噻唑啉酮、链霉素以及青霉素，对常见细菌、真菌、藻类等具有很强的抑制和杀灭作用，可针对性的防止脐带组织在清洗过程中被微生物感染，相对于普通的生理盐水冲洗，具有更好的抗菌效果。

16、(2)本发明使用生理盐水为基础，加入了各种抗生素，通过控制各个成分的含量，可以在冲洗过程中，保证牙髓组织不被微生物感染的前提下，维持牙髓组织的形态结构和生物活性，延长牙髓组织的保存时间，提高牙髓组织干细胞的得率。

17、(3)本发明提供的牙髓干细胞的分离制备方法中，通过对牙齿消毒清洗方法的调整，使用胶原酶和中性蛋白酶对牙髓组织进行消化，能够有效降低牙髓干细胞分离制备过程中被污染的风险，有利于促进牙髓干细胞的爬出，提高牙髓干细胞的纯度和获得率，有利于后续牙髓干细胞培养过程中的增殖，为工业上高效分离制备牙髓干细胞提供了理论指导。

技术特征：

1.一种牙髓组织干细胞的分离制备方法，包括以下步骤：

2.一种根据权利要求1所述的一种牙髓组织干细胞的分离制备方法中的牙髓组织清洗液，其特征在于，包括：生理盐水：100ml；青霉素：14mg～20mg；链霉素：14mg～20mg；异噻唑啉酮：8mg～10mg。

3.根据权利要求2所述的一种牙髓组织干细胞的分离制备方法，其特征在于，所述的牙髓组织清洗液的制备方法包括：

4.根据权利要求3所述的一种牙髓组织干细胞的分离制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，将所述的清洗液使用0.22μm滤器过滤得到过滤液；然后将过滤液稀释至1000ml得到二次清洗液；最后进行分装，每瓶100ml，分装、真空封口并低温保存。

5.根据权利要求3或4所述的一种牙髓组织干细胞的分离制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)(2)均需在无菌环境中操作。

技术总结本发明涉及牙髓组织处理技术领域，特别涉及一种牙髓组织干细胞的分离制备方法及其牙髓组织清洗液。本发明提供的一种牙髓组织干细胞的分离制备方法及其牙髓组织清洗液，通过在分离制备过程中使用牙髓组织清洗液，从而降低了牙髓干细胞分离制备过程染菌的风险，提高了牙髓干细胞的纯度和获得率。技术研发人员：赵丹丹,张百峰,李盼,段瑞雪,罗广震,李芬,李世香,李晶晶,马雪娇,田艳玲受保护的技术使用者：山东水发生命科学研究有限公司技术研发日：技术公布日：2024/9/29