一种党参多倍体诱导及其高效人工育苗方法

本发明涉及党参繁殖，具体涉及一种党参多倍体诱导及其高效人工育苗方法。

背景技术：

1、本节中的陈述仅提供与本技术公开相关的背景信息，并且可能不构成现有技术。

2、党参codonopsis pilosula(franch.)nannf.是桔梗科campanulaceae党参属codonopsis多年生草质藤本植物，生于海拔1560-3100m的山地林边及灌丛中。党参被中国、日本和韩国等亚洲国家用于食品和民间医学已有几千年的历史。党参、素花党参c.pilosula nannf.var.modesta(nannf.)l.t.shen和川党参c.tangshen oliv的干燥根被《中国药典》收录，共同组成中药党参的基原植物；中医传统医学认为这三种植物的干燥根具有健脾益肺，养血生津的功效，可以治疗脾肺气虚，咳嗽虚喘，气血不足等病症。党参根中的皂苷、多糖、三萜、生物碱等多种次生代谢产物，使党参具有多种药理活性，包括免疫调节、抗氧化、抗病毒、抗癌、抗炎等功能。独特的生物活性和无毒性使党参在药用和食用中颇受欢迎。因党参生物活性与人参相似且价格便宜，党参也常常被作为人参panax ginsengc.a.mey.的替代品，《中国药典》记录了100多种含有党参根或根提取物的中药制剂。同时，党参中还含有蛋白质、维生素、矿物质等营养成分，经常以保健品的形式出现在民间，尤其用来煲汤、制茶、煮粥和泡酒等。此外，党参地上部分中的大量化学成分类型与地下部分相同，可以加工为饲料出售，且叶片中的抗氧化活性、蛋白质、氨基酸、总黄酮和总多酚水平要高于地下部分。这种全草都具有商业价值的药用植物，使党参具有巨大的市场潜力。

3、多倍体对植物育种最重要的贡献是细胞大小的增加(“gigas”效应)、有害突变的缓冲、杂合度的增加、以及杂种优势(杂交优势)的利用等。植物多倍体促进的这些变化使多倍体个体在极端环境中生存下来，并在竞争中可能胜过许多二倍体祖先；同时，这些变化也使人们对开发应用于植物育种目的的多倍体产生了越来越大的兴趣；研究者们利用多倍体的这些特性选育出了产量较高、品质较好的品种，增强了对生物和非生物胁迫的耐受性。对植物多倍体的研究至今已有100多年的历史，发现多倍体在植物中是普遍存在的，且多倍体被普遍认为是一种常见的物种形成模式，对植物进化和生态学产生了极其深远的影响。尽管如此，由于多倍体植株的数量有限，难以提供多倍体育种所需要的有着丰富遗传背景的大量群体。为了解决这一问题，育种学家通常会选择合适的材料，以人工诱导的手段来达到扩大多倍体植株基数的目的。秋水仙素诱导是人工诱导多倍体最常用的方法之一，其可阻碍细胞分裂中期纺锤丝的形成，使有丝分裂被迫中断，但细胞和细胞质并不分离，从而使染色体加倍。目前，人工诱导多倍体在植物方面已得到越来越广泛的应用，如在麻疯树(jatropha curcas l.)、拟南芥(arabidopsis thaliana(l.)heynh.)、尖瓜(trichosanthsdioica roxb.)、玫瑰(rosa rugosa thunb.)、小麦(triticum aestivum l.)、紫锥菊(echinacea purpurae l.)等植物中都进行了多倍化尝试。尽管多倍体存在着种子不育性增加和生长周期延长、开花延迟等不足和缺点，但人工诱导的多倍体依然被用于植物育种遗传改良实验，因为这种技术一方面通常会提高植物相关经济部分的生物量；另一方面，染色体的加倍明显促进了次生代谢物的产生和增加，有助于目标植物增加商业价值，特别是能提高有效成分含量。

4、多倍体化方法主要有体外诱导体系和体内诱导体系，最常用的方法是体外诱导，它可以在有限的空间里使多倍体植物快速发育。体外人工诱导多倍体依赖于组织培养技术，高效和可重复性是体外诱导的基础。同时，外植体类型、外植体年龄、培养基、植物生长调节剂、添加剂等，会直接影响体外再生研究和基于体外的育种方法。目前，党参倍性育种的研究较少，有学者利用党参种子诱导了四倍体，并以胚轴为外植体诱导愈伤组织建立快繁体系，但诱导率和增殖系数并不理想；也有学者采用含有秋水仙碱的琼脂凝胶涂抹党参幼苗生长点的方法成功诱导了四倍体植株，但并没有解决同源四倍体党参大规模繁殖这一关键问题，但表明党参同源四倍体植株较二倍体亲本在叶片、茎、花器等方面具有显著差异。基于此，需要寻求一种新的成本低、时间短、质量和成活率高，且能将多倍体性状固定下来的无性繁殖方法来扩大党参多倍体种苗的繁殖量，进行高品质种苗的工厂化生产，以满足种植需求。

技术实现思路

1、本发明的目的在于：针对目前党参同源四倍体大规模繁殖难的问题，提供了一种党参多倍体诱导及其高效人工育苗方法，通过多倍体诱导解决党参药用部位——根产量的大幅提高，并提供一种能够提高多倍体植株快速繁殖效率的方法，该方法可为固定多倍体优质性状、发展人工种植奠定技术基础。通过本发明，可提供基因型背景一致的优质多倍体种苗以满足人工种植的需求。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种党参多倍体诱导及其高效人工育苗方法，包括如下步骤：

4、步骤(1)：外植体的获取：选择生长势好、无病虫害的健壮植株，取其幼嫩至少带一个节、约1.0-1.5cm长的茎尖；

5、步骤(2)：外植体消毒接种预培养：将步骤(1)获取的茎尖进行消毒处理，随后接入培养基a中，控制光照度、温度、光照时间进行预培养，带节茎尖基部开始稍有膨大。

6、优选地，培养基a包括以下原料：

7、ms基本培养液：

8、6-苄胺基嘌呤(6-ba)、激动素(kt)、α-萘乙酸(naa)、椰子汁、蔗糖和琼脂粉。

9、步骤(3)：秋水仙素溶液浸泡处理：取步骤(2)基部开始稍有膨大的茎尖在经高温灭菌后(质量比)为0.05％的秋水仙素溶液中浸泡处理12h；

10、步骤(4)：取步骤(3)中处理后的茎尖经清洗后接种于添加0.05％秋水仙素的新鲜培养基a中，控制光照度、温度、光照时间的条件下进行培养60-72h；

11、步骤(5)：取步骤(4)处理后的茎尖转入新的不含秋水仙素的培养基a中，控制光照度、温度、光照时间的条件下进行培养，获得愈伤组织及不定丛芽；

12、步骤(6)：取步骤(5)诱导出的多倍体不定芽转入培养基b中进行单株扩繁建立单性系；

13、优选地，所述多倍体不定芽为叶片较同期二倍体叶片肥大的不定芽。

14、优选地，所述培养基b，包括以下原材料：

15、ms基本培养液：

16、6-苄胺基嘌呤(6-ba)、激动素(kt)、α-萘乙酸(naa)、椰子汁、蔗糖和琼脂粉。

17、步骤(7)：流式细胞仪初筛四倍体植株，将通过流式细胞仪初步鉴定的四倍体植株编号并将每一个单性系中的不定芽修剪后扦插于灭菌基质中控制环境条件诱导生根；

18、优选地，不定芽的修剪方式为：将每个芽剪为2-3cm、带2个节。

19、优选地，所述环境条件为温度20-25℃，湿度在80-90％。

20、步骤(8)：对步骤(7)中的不定芽生成的根尖进行染色体制片二次鉴定四倍体植株；优选地，二次鉴定四倍体植株具体为15d后随机取20株，每株2个根尖，共40个根尖进行染色体制片；此步骤至少连续重复3代，以确保获得的植株为纯合四倍体；

21、步骤(9)：将步骤(8)鉴定的多倍体植株进行扩繁：将确定为多倍体的植株按编号对应瓶内试管苗，转新鲜培养基b中进行扩繁；

22、步骤(10)：将步骤(8)扩繁得到的丛生芽修剪后插入灭菌基质中，无菌水喷湿基质后控制环境条件为20-25℃，湿度在80-90％进行生根培养，30d后即可获得苗壮根粗的生根苗。

23、优选地，丛生芽的修剪方式为：将每个芽剪为2-3cm、带2个节。

24、步骤(11)：移栽：将步骤(10)的生根苗进行自然条件下炼苗，每天太阳落山后轻喷100ml自来水，炼苗结束后移栽获得定植苗。

25、优选地，步骤(7)和步骤(10)的扦插可以是将修剪后的丛生芽轻轻插入于装有经高温灭菌基质的泡沫箱中，随后在基质表面轻喷无菌水，最后用透明保鲜膜将泡沫箱封口，置于阴凉有光的地方培养(光照强度)。泡沫箱内温度在20-25℃，湿度在80-90％左右，30d后即可获得苗壮根粗的生根苗。泡沫箱内径长宽高可以为36×26×15cm。

26、优选地，步骤(2)中外植体消毒的方法具体可以为：自来水洗净表面后用质量百分比10％洗衣粉溶液浸泡5min并轻微震荡搅动后，流水冲洗30min，置于超净工作台上用体积百分比75％乙醇溶液处理5s，再用质量百分比0.05％升汞水溶液灭菌8-10min，无菌水冲洗3次，每次不低于3min，在整个消毒过程中充分摇动器皿，最后将材料置于无菌吸水纸上，吸干其表面水分后用无菌手术刀将材料茎的伤口处切去0.2cm，按生理学方向垂直接入培养基a中。

27、优选地，培养基a具体包括如下含量的各组分：1.0-1.5mg/l的6-苄胺基嘌呤(6-ba)、0.5-1.0mg/l的激动素(kt)、0.1-0.5mg/l的α-萘乙酸(naa)、50-60ml/l的椰子汁、30000mg/l的蔗糖和4700mg/l的琼脂粉。

28、优选地，所述培养基a的ph值为5.4-5.8。

29、根据一种优选的实施方式，所述步骤(3)中用于浸泡的茎尖为带叶茎尖，所述带叶茎尖的长度为1.0-1.5cm。

30、根据一种优选的实施方式，所述步骤(4)中的茎尖的清洗为使用无菌水冲洗3次，每次不低于3min。

31、根据一种优选的实施方式，所述步骤(4)中的培养周期为60-72h。

32、根据一种优选的实施方式，培养基b，包括以下原料：1.5-2.5mg/l的6-苄胺基嘌呤(6-ba)、1.0-1.5mg/l的激动素(kt)、0.5-1.0mg/l的α-萘乙酸(naa)、50-60ml/l的椰子汁、30000mg/l的蔗糖和4700mg/l琼脂粉。

33、本培养基培养能够同时适应丛生芽诱导和增殖使用，并且均具有良好的诱导芽生成和增殖的效果，简化实验流程。

34、本培养基中的6-苄胺基嘌呤(6-ba)和α-萘乙酸(naa)的浓度配合，彼此协同能够诱导出大量的愈伤组织并促进丛生芽的生长；同时椰子汁的加入，极大促进了丛生芽的产生，共同作用促进了丛生芽的生成和增殖。不设置椰子汁的培养基b中的愈伤组织仅产生愈伤组织膨大而无法产生大量丛生芽，因此难以实现丛生芽的诱导和增殖，不利于后续进程继续进行。

35、优选地，所述培养基b的ph值为5.4-5.8。

36、进一步地，步骤(7)和(10)中所述基质为泥炭土:珍珠岩＝3:1，灭菌温度为125℃、时间25min；基质厚度为4-6cm，用无菌水将基质浸湿备用。

37、与现有的技术相比本发明的有益效果是：

38、1、一种党参多倍体诱导及其高效人工育苗方法，本发明采用秋水仙素浸泡和在愈伤组织和不定芽诱导培养基中加入的方式作用，诱导成功率较高(最高达23.59％)；在每一代中均做根尖压片来确定四倍体而淘汰嵌合体，3代后可完全淘汰嵌合体。诱导得到了四倍体的党参愈伤组织和丛生芽，随后再基于组培的方式对丛生芽和愈伤组织进行扩繁，结合“微扦插”的方式控制环境条件成功诱导了培养的组培苗生根获得了大量可以炼苗移栽的生根苗，繁殖系数达到41.15，实现了多倍体党参植株的高效快速繁殖；

39、2、一种党参多倍体诱导及其高效人工育苗方法，在多倍体诱导成功的基础上，优化了培养基配方，使得多倍体生长延缓的状况缓解往常在相同培养基和培养条件下，多倍体瓶苗的生长周期往往是二倍体的1.5倍，而本技术中的多倍体植株的转接周期可与二倍体植株的转接周期几乎相同；

40、3、一种党参多倍体诱导及其高效人工育苗方法，本技术的离体诱导方式即组织培养诱变法容易控制实验条件，由此可以确保获得四倍体植株后，能够人工进行单性系快速繁殖，证实了与活体诱导相比，本技术的离体诱导更具优越性；

41、4、本发明将组织培养中的不定根诱导拓展到瓶外相对有菌条件下进行诱导，即瓶外“微扦插”技术，其生根率远比瓶内为高，且成活率高、生长量大。推测产生其效果的原因为：插条均为幼嫩不定芽，其内源生长素水平相对较高，且瓶外基质中拥有多种有益物质和较好的透气性；瓶外“微扦插”技术可为其他生根、移栽顽拗性品种提供借鉴；

42、5、多倍体特别是同源多倍体在染色体加倍后可带来营养器官的巨大性变化，通过多倍体育种培育更为速生、优质的党参品种，可缩短栽培利用周期，提高产业价值；由于多倍体的基因剂量倍增，使植物的一些生理生化过程随之加强，新陈代谢旺盛，其体内的某些生化成分的含量也相应提高。在党参育种中，多倍体育种可望使利用组织代谢产物的相关品质性状得到改善提高，如皂苷等，从而提高其利用价值，降低生产成本；多倍体植株生活力强，对环境适应性和抗逆力很强。从植物地理分布上看，多倍体大多出现在高纬度、高海拔以及北极、沙漠等气候环境变化剧烈的地区，进一步说明多倍体植株比通常的二倍体具有更强适应不利自然条件的能力；通过多倍体育种可提高党参种苗的抗逆性，扩大其栽植范围；

43、6、本发明用组织培养技术在培养室内可实现周年生产，既节约了土地资源，又提高了经济效益，克服了传统营养繁殖方式无法周年进行生产的难点；本发明实现了高效快繁的目的，40d为一个增殖培养周期，不仅解决了多倍体植株繁殖困难的问题，且在较短的时间内获得了极高的增殖系数，其效益可观；

44、7、本发明仅需一株确定加倍成功的多倍体植株，便可在同一培养基中利用直接器官发生方式完成增殖和生根过程，既可在满足大规模生产需要的同时，又保持了多倍体的优良性状，为其人工快繁最有效的增殖方式，且提高了种苗质量；

45、8、本发明简化了培养程序，在多倍体诱导成功后，整个快速繁殖过程只需1种培养基就解决了完成了愈伤组织-不定丛芽-愈伤组织-不定丛芽的循环过程，利于安排生产计划；

46、9、本发明将不定根诱导和驯化有机地结合在一起，体外“微扦插”的实施，使赢弱的丛生苗复壮、生根和驯化达到一体化，不但极大地缩短育苗周期，并且解决了在党参中一直困扰育种工作者组培苗驯化死亡率高的问题；体外“微扦插”使幼苗移栽成活率高，且生长迅速；目前在已进行示范栽培，效果很好；

47、10、本发明对党参种质改良和快速繁殖具有重要意义和价值，同时也可为其他多年生草本类药用植物的离体加倍和快速繁殖提供技术参考。