一种从猕猴桃叶片到完整植株的快速诱导培养基及方法

本发明涉及一种从猕猴桃叶片到完整植株的快速诱导培养基及方法，属于生物。

背景技术：

1、在我国，首次对猕猴桃组织培养技术进行探究的是桂耀林(猕猴桃离体茎段愈伤组织的诱导和植株再生[j].journal of integrative plant biology，1979，(04)：339-344)在1979年成功诱导出愈伤组织，实现了植株再生；而遗传转化是植物细胞工程的重要方法，植物细胞工程作为资源创新的有效手段，已在柑橘(王平，唐小浪，马培恰等：辐射诱变和芽变柑橘品种(系)的aflp分析[j].果树学报，2012，29(1)：130-134.)、火龙果(邓仁菊，范建新，王永清等：火龙果幼苗离体辐射诱变及其对低温胁迫的生理响应[j].热带作物学报，2018，39(2)：260-266.)等很多园艺植物上被广泛应用并获得了变异植株。

2、此外，通过完善的离体再生体系已成功获得了转基因植株(王爱连，王平平，梁东等，阔叶猕猴桃galdh基因植物表达载体的构建及转化番茄的研究[j].西北农业学报，2012，21(1)：130-135.)，黄丽娜等(黄丽娜，陈清西，园艺植物组培育苗技术研究进展[j].北方园艺，2012，(22)：184-188.)在园艺植物组培育苗技术研究进展中发现，植物无性繁殖的有效途径可以通过组织培养来实现。20世纪70年代以来，国内外许多学者(陈正华，木本植物组织培养[j].北京高等教育出版社.1986)对猕猴桃组织培养进行了广泛的研究，尤其是在培养基的激素组合方面有很多报道，但是，结果却不尽一致。

3、建立高效的遗传转化体系，需要有相应的支持生长筛选的培养基，但是，目前，关于猕猴桃培养基配置方面的研究较少，在优化猕猴桃愈伤组织诱导及再生芽诱导培养基方面鲜有报道。

4、目前，在猕猴桃愈伤组织培养中，常以玉米素(zt)，6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)，2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-d)三种激素作为研究诱导猕猴桃愈伤组织的主要对象(刘政，曲淼，杨殿静等：植物生长调节剂对软枣猕猴桃茎愈伤组织生长分化的影响[j].落叶果树，2021，53(05)：25-28；赵文娟，吴杰新，张汉尧：‘徐香’猕猴桃离体快繁研究[j].云南农业科技，2020(03)：4-7.)。陈洪国等(陈洪国，熊月明：不同外植体和生长调节剂对猕猴桃愈伤组织形成与再分化的影响[j].福建果树，2001(04)：3-4.)研究zt、6-ba、2，4-d三种激素分别对猕猴桃愈伤组织诱导的试验中，得出结论：加入zt的效果优于6-ba和2，4-d，即zt最有利于猕猴桃愈伤组织的形成和再分化。在探讨植物生长调节剂对软枣猕猴桃茎段愈伤组织生长及分化效应的过程中，刘政等(刘政，曲淼，杨殿静等：植物生长调节剂对软枣猕猴桃茎愈伤组织生长分化的影响[j].落叶果树，2021，53(05)：25-28.)对zt(细胞分裂素类)、6-ba(细胞分裂素类)、萘乙酸(naa，生长素类)、2，4-d、赤霉素(ga3)等不同浓度组合，其研究结果表明，ms培养基中添加1.0mg/l的6-ba与0.2mg/l的naa，在促进愈伤组织生长方面表现最佳，不仅显著延缓了褐化现象，且有效促进了根的分化。zt对猕猴桃愈伤组织的增殖、根、芽的再分化诱导和生长均有显著的效果，然而，鉴于zt的价格较为昂贵，实际的生产应用中会增加成本负担。

5、愈伤组织生芽是一个关键步骤，如果培养基配方不佳，可能会导致愈伤组织水渍化、褐化、玻璃化等问题的产生，进而影响到芽点的形成和生长。

6、因此，提供一种从猕猴桃叶片到完整植株的快速诱导培养基及方法，有效遏制愈伤组织水渍化、褐化、玻璃化等问题的产生，不仅增加生芽的数量，还提高芽点的质量，有利于愈伤组织的生长分化，使其更易于分化为芽点，不仅增加了生芽的数量，还提高了芽点的质量，为后续的遗传转化实验打下坚实的基础；为猕猴桃的遗传改良和品种优化提供更加有力的支持，为不断地优化和改进遗传转化体系提供更加有力的支持，以及深入研究各种基因在猕猴桃体内的机制、为猕猴桃产业的发展贡献更多的力量；就成为该技术领域急需解决的技术难题。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的不足，本发明的主要目的是提供一种从猕猴桃叶片到完整植株的快速诱导培养基及方法，有效遏制愈伤组织水渍化、褐化、玻璃化等问题的产生，不仅增加生芽的数量，还提高芽点的质量，有利于愈伤组织的生长分化，使其更易于分化为芽点，不仅增加了生芽的数量，还提高了芽点的质量，为后续的遗传转化实验打下坚实的基础；为猕猴桃的遗传改良和品种优化提供更加有力的支持，为不断地优化和改进遗传转化体系提供更加有力的支持，以及深入研究各种基因在猕猴桃体内的机制、为猕猴桃产业的发展贡献更多的力量。

2、本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：

3、一种从猕猴桃叶片快速诱导成芽的愈伤组织诱导培养基，包括6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)、萘乙酸(naa)、噻苯隆(tdz)、ms培养基、蔗糖、琼脂，其重量配比为：ms培养基0.002％-0.006％、蔗糖0.01％-0.05％、6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)0.000001％-0.000003％、萘乙酸(naa)0.0000002％-0.0000008％、噻苯隆(tdz)0.000001％-0.000003％、琼脂0.006％-0.01％，余量为水。

4、优选地，其重量配比为ms培养基0.003％-0.005％、蔗糖0.02％-0.04％、6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)0.0000015％-0.0000025％、萘乙酸(naa)0.0000003％-0.0000007％、噻苯隆(tdz)0.0000015％-0.0000025％、琼脂0.007％-0.009％，余量为水。

5、优选地，其重量配比为ms培养基0.00443％、蔗糖0.03％、6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)0.000002％、萘乙酸(naa)0.0000005％、噻苯隆(tdz)0.000002％、琼脂0.008％，余量为水。

6、本发明的另一目的是提供一种从猕猴桃叶片快速诱导成芽的愈伤组织诱导芽培养基。

7、本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：

8、一种从猕猴桃叶片快速诱导成芽的愈伤组织诱导芽培养基，包括6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)、萘乙酸(naa)、ms培养基和蔗糖，其重量配比为：ms培养基0.002％-0.006％、蔗糖0.01％-0.05％、6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)0.0000005％-0.000003％、萘乙酸(naa)0.00000005％-0.0000002％、琼脂0.006％-0.01％，余量为水。

9、优选地，其重量配比为：ms培养基0.003％-0.005％、蔗糖0.02％-0.04％、6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)0.00000075％-0.00000125％、萘乙酸(naa)0.000000075％-0.000000125％、琼脂0.007％-0.009％，余量为水。

10、优选地，其重量配比为：ms培养基0.00443％、蔗糖0.03％、6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)0.000001％、萘乙酸(naa)0.0000001％、琼脂0.008％，余量为水。

11、本发明的另一目的是提供一种从猕猴桃叶片快速诱导成芽的方法。

12、本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：

13、一种从猕猴桃叶片快速诱导成芽的方法，其步骤如下：

14、(1)‘脐红’猕猴桃叶片诱导愈伤组织

15、1)取容量瓶，加入ms培养基和蔗糖，用水定容，加入对应浓度的激素6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)、萘乙酸(naa)、噻苯隆(tdz)，进行溶解搅拌；

16、2)调节ph值，直至溶液的ph值稳定在5.8-5.9之间；

17、3)调整ph后，再往溶液中加入琼脂，配置成愈伤组织诱导培养基；

18、4)灭菌；灭菌完成后，培养基在室温静置到50-60℃，将培养基依次分批倒入培养皿中并做好标记，冷却凝固，用封口膜将其密封待用；

19、5)选取‘脐红’猕猴桃继代组培苗(选取叶子嫩绿，长势良好的)；

20、6)组培苗放入超净工作台中，在酒精灯前打开瓶盖，用无菌剪刀剪下‘脐红’猕猴桃组培瓶中的叶片，用镊子夹出，放在无菌滤纸上，将猕猴桃组培苗叶片剪成1cm左右的叶片，随后，将剪好的叶片近轴面向下紧贴培养基，每个培养基上接种9个叶片，重复3个培养基，接种完毕，用封口膜密封，移至组培室内避光培养，每隔10天观察愈伤组织生长情况，并统计各培养基中愈伤组织诱导率；

21、(2)愈伤组织诱导芽

22、1)取容量瓶，加入ms培养基和蔗糖，用水定容，加入对应浓度的激素6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)、萘乙酸(naa)，进行溶解搅拌；

23、2)调节ph值，直至溶液的ph值稳定在5.8-5.9之间；

24、3)调整ph后，再往溶液中加入琼脂，配置成愈伤组织诱导培养基；

25、4)灭菌；灭菌完成后，培养基在室温静置到50-60℃，将培养基依次分批倒入培养皿中并做好标记，冷却凝固，用封口膜将其密封待用；

26、5)快速灭菌器，随后取出冷却，组培室内选取上一阶段诱导出来长势良好的愈伤组织，作为进行诱导芽的材料；

27、6)将愈伤组织放入超净工作台中，夹取叶片上长势良好的愈伤组织，放在滤纸上，将愈伤组织从叶片中剪下，用镊子将其放入芽诱导的培养基中，每个培养基中接种五个，在操作时使五个愈伤组织均匀分布，重复3个培养基，接种完毕用封口膜密封，移至组培室内培养，观察愈伤组织生长情况；

28、7)20天以后，观察记录芽诱导情况，分析数据结果。

29、本发明的再一目的是提供从猕猴桃叶片到完整植株的快速诱导配方的应用。

30、从猕猴桃叶片到完整植株的快速诱导配方的应用，用于从‘脐红’猕猴桃叶片到完整植株的快速诱导。

31、有益效果：

32、本发明的从猕猴桃叶片到完整植株的快速诱导培养基及方法，有效遏制愈伤组织水渍化、褐化、玻璃化等问题的产生，不仅增加生芽的数量，还提高芽点的质量，有利于愈伤组织的生长分化，使其更易于分化为芽点，为后续的遗传转化实验打下坚实的基础；为猕猴桃的遗传改良和品种优化提供更加有力的支持，为不断地优化和改进遗传转化体系提供更加有力的支持，以及深入研究各种基因在猕猴桃体内的机制、为猕猴桃产业的发展贡献更多的力量。

33、下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护的范围的限制。