一种山慈菇栽培菌种及其制备工艺

本发明属于生物，具体涉及一种山慈菇栽培菌种及其制备工艺。

背景技术：

1、兰科植物杜鹃兰 cremastra appendiculata(d. don)makino> 加工药材俗称毛慈菇，假鳞茎加工后入药，药材名称“山慈菇”具有味甘、微辛，性凉，具有清热解毒、消痈散结等功效，常用于痈肿疔毒、瘰疬痰核、蛇虫咬伤、瘸瘕痞块。现代有文献研究发现，山慈菇提取物能够抑制血管形成，此作用机制在抗肿瘤方面有较好的前景。现代临床用于治疗肝硬化、食管贲门癌梗阻、宫颈癌等。山慈菇中丰富的多酚类成分，特别是独蒜兰属醇、联苄类成分如独蒜兰素c、d和独蒜兰醇，以及其他活性物质，如杜鹃兰素和感烷酮-3-醇类，构成了其强大的生物活性基础。临床应用主要以消痰、解毒为主，还有抗肿瘤、降压等作用广泛用于治疗多种疾病。制药企业吸纳作投料的用量日趋增长，大型中医院、民营医院药用配方的用量也在增加中。产量逐年减少，用量逐年增加，供不应求日益加剧。

2、山慈菇属于兰科植物，其种子极小、数量大，果荚内有种子2万～3万粒。但无胚乳，自然界萌发率极低，野生资源有限，相应市场需求旺盛，导致野生种群数量急剧减少。目前，山慈菇栽培菌种尚未发现公开的菌种，主要繁殖技术仅限于两种，第一种是山慈菇种子无菌萌发成苗后栽培；第二种是假鳞茎营养繁殖。第一种因需要在无菌环境培育种苗，形成的种苗还需要炼苗后种植等程序，技术要求高、成本高、成活苗少，不宜大规模栽培；第二种栽培因属于营养繁殖，每年每株才产生1个假鳞茎，繁殖效率极低。据了解，市场生产山慈菇菌种多处在试验阶段，目前，生产多按传统一级种、二级种、三级种的固体菌种生产模式，一级种生长多在10～15天，二级种26～27天，三级种固体菌种生长期在70～80天左右。拌料5～6个工/10000袋，灭菌2～3个工/10000袋，装袋12～15个工/10000袋，接菌34～36个工/10000袋，存在用工量大、二级种生产需要塑料瓶成本增加、生长周期长等问题。且传统固体菌种因灭菌后袋口干失活占5%～6%，杂菌感染3%～4%，平均4%～5%，存在易感染、有失活现象等问题，造成坏袋，增加了损失。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种接菌快且省工、省料的山慈菇栽培菌种的制备工艺，以及采用该工艺制备得到的山慈菇栽培菌种。

2、针对上述目的，本发明采用的山慈菇栽培菌种的制备工艺包括下述步骤：

3、步骤1：将液体培养基装于锥形瓶中，高温高压灭菌后冷却至室温，接种辐毛小鬼伞（ coprinus radians）n2，在摇床上培养至锥形瓶中培养液出现大量白色絮状菌丝或者球状菌球，静置后培养液变得清澈，无明显分层现象，且在无菌条件下通过显微镜观察无细菌感染，作为液体菌种。

4、步骤2：将扩大培养基装于发酵罐中，高温高压灭菌后冷却至室温，将步骤1锥形瓶中的液体菌种倒入发酵罐的扩大培养基中进行扩大培养，培养至发酵罐中出现大量白色絮状菌丝或者球状菌球，静置后培养液变得清澈，无明显分层或者漂浮物出现，通过排气闻到无酸味或者臭味，且在无菌条件下通过显微镜观察无细菌感染，作为二级液体菌种。

5、步骤3：将栽培基质用装袋机装入耐高温且无毒的塑料袋中，装到至距离袋口3～6cm处，中心插入直径2～3mm成型管，套上扣环，用耐高温高压盖子封口后，高温高压灭菌后冷却至室温。

6、步骤4：将步骤3中冷却至室温的袋装栽培基质通过传送带送到接种室，在无菌环境下取下盖子打开塑料袋，拔出成型管，通过接种枪将步骤2发酵罐中的二级液体菌种从成型管形成的通道注入栽培基质内，再用盖子封口。

7、步骤5：通过自动传送带将步骤4中接好菌种的袋装栽培基质输出接种室，装筐送入温度15～25℃、湿度50%～60%的环境室内暗室培养，培养5～7天后上下倒筐，再继续培养12～15天，获得山慈菇栽培菌种。

8、上述步骤1中，所述液体培养基是按每1000ml纯净水加入土豆淀粉2.5～3.5g、黄豆粉1.5～2.5g、玉米粉0.8～1.2g、蛋白胨2.5～3.5g、一水葡萄糖15～25g、磷酸二氢钾0.7～0.75g、硫酸镁1.5～2.5g、酵母膏 2.5～3.5g配制而成，其ph为7.5～8。

9、上述步骤1中，所述高温高压灭菌的温度为120～125℃、压力为0.12～0.15mpa，灭菌时间为30～40min。

10、上述步骤1中，所述辐毛小鬼伞（ coprinus radians）n2于2023年11月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no：40970。

11、进一步，上述步骤1中，所述辐毛小鬼伞（ coprinus radians）n2的接种量为液体培养基体积的2.5%～3%，在摇床上培养的温度为20～25℃，培养时间为36～72小时。

12、上述步骤2中，所述扩大培养基是按每200l纯净水加入土豆淀粉580～620g、黄豆粉580～620g、玉米粉180～220g、蛋白胨580～620g、一水葡萄糖3800～4200g、高纯磷酸二氢钾130～150g、硫酸镁 380～420g、酵母膏580～620g配制而成，其ph为7.5～8。

13、上述步骤2中，所述高温高压灭菌的温度为120～125℃、压力为0.12～0.15mpa，灭菌时间为70～80min。

14、进一步，上述步骤2中，所述液体菌种的加入量为扩大培养基体积的0.3%～0.6%，所述扩大培养的温度为20～25℃，培养时间大于48～72小时。

15、上述步骤3中，所述栽培基质是基质与水质量比1：1.1～1.5的混合物，其ph为6.5～7；所述基质的质量百分比组成为：木屑50%～60%、棉籽壳颗粒20%～28%、麸皮17%～20%、石膏1%～1.5%、白糖1%～1.5%、葡萄糖0.3%～0.6%。所述栽培基质的制备方法为：按照栽培基质的组成，将木屑、棉籽壳颗粒、麸皮、石膏拌匀，将白糖和葡萄糖用水溶解，然后将两者混拌均匀。其中所述木屑的直径为0.8～1.2cm。

16、上述步骤3中，所述高温高压灭菌的温度为120～125℃、压力为0.12～0.15mpa，灭菌时间为150～200min。

17、上述步骤3中，所述耐高温且无毒的塑料袋为聚丙烯或者聚乙烯材质的食用菌专用袋，所述耐高温高压盖子为聚丙烯材质含空气过滤棉的盖子。

18、上述步骤4中，所述二级液体菌种注入量为栽培基质重量的0.01%～0.02%。

19、本发明的有益效果如下：

20、本发明利用辐毛小鬼伞（ coprinus radians）n2为母种，经锥形瓶中的液体培养基摇床培养后在发酵罐中进行扩大培养，获得的二级液体菌种接入栽培基质中于室内养菌，获得山慈菇栽培菌种。本发明通过优化栽培基质配比和制备工艺，保证上下湿度均匀，菌种生长好，种入地里传菌快且持久，对山慈菇种子接菌、萌发、生长发芽、展叶期间的生长关键环节提供了优质持久的生长营养；同时采用液体接菌制菌的方法，一级液体培养、二级扩大培养后直接接菌培养，降低了转接代数，菌种活力高、接菌快且省工、省料，杂菌感染率低，菌种易成活、生长快。与传统固体菌种相比，本发明工艺拌料2～3个工/10000袋，灭菌2～3个工/10000袋，装袋12～15个工/10000袋，接菌11～18个工/10000袋，省工一半；在20～25℃，湿度50～60%条件下培养，比传统菌种时间提前了40～50天。本发明方法培育的菌种，菌种营养供应在90天以上，营养丰富、供应营养时间长，且栽培菌种失活为0%，杂菌感染0.3%～0.5%，平均0.3%～0.5%，损失降低10%，省工18～20个/10000袋/批次；在20～25℃，湿度50～60%条件下培养，比传统固体菌种生长时间缩短40～50天。