一种用于鉴别表达IBDVVP2基因的重组MDV疫苗株的引物、试剂盒、方法及其应用

本发明属于病毒检测，具体涉及一种用于鉴别表达ibdv vp2基因的重组mdv疫苗株的引物、试剂盒、方法及其应用。

背景技术：

1、传染性法氏囊病病毒(ibdv)引起鸡的传染性法氏囊病(ibd)，该病是一种急性、高度接触传染性、杀淋巴细胞性疾病，主要发生于3～8周龄的幼鸡。病鸡精神沉郁、羽毛蓬乱、下痢、震颤、共济失调。该病的发病率可达100％，死亡率5％～15％，有时高达20％以上，并发或继发感染所致的死亡率更高。该病于1957年首次爆发于美国，现已大面积流行于欧州、东南亚、非州、南美洲，被世界动物卫生组织(oie)列为“影响社会经济的重要疾病”。ibd在我国的流行情况也比较严重，一直威胁着我国养禽业的发展。抗原变异、免疫抑制，特别是超强毒株(vvibdv)的出现，使得该病的防控形势更加严峻。疫苗免疫是防控vvibdv的主要手段，但vvibdv致病性强且不适应细胞培养，疫苗株的获得只能通过将野生vvibdv在鸡胚或cef细胞上传代致弱。这种传统的驯化方法费时费力，且结果带有随机性。因此，开展新型疫苗的快速构建具有重要意义。

2、重组活载体疫苗是用基因工程技术将病毒或细菌构建成一个载体，然后把外源基因插入其中使之表达的活疫苗。该类疫苗诱导机体产生的免疫比较广泛，可以同时表达多种抗原，制成多价或多联疫苗，起到一针防多病的效果，是当今和未来疫苗研发的主要方向之一。马立克氏病病毒(mdv)属于α-疱疹病毒科马立克氏病毒属，基因组为线性双股dna，分子量约为166-180kb。该疱疹病毒基因组较大，可供外源基因插入或替换的复制非必需基因多，是一种理想的构建重组活载体疫苗的病毒载体。本发明发明人在前期的研究中，建立了mdv弱毒疫苗814株多片段粘粒感染性克隆拯救系统(公开于申请公布号为cn104830883a的发明专利申请中)。在此基础上，本发明发明人在mdv基因组中鉴定出可供外源基因插入的复制非必需区，并将ibdv vp2基因插入mdv基因组us2基因的内部，构建了表达ibdv vp2基因的重组mdv疫苗株，用于免疫无特定病原鸡(spf鸡)能使spf鸡产生良好的对抗ibdv的抗体，同时还不影响mdv的免疫效果(公开于授权公告号为cn105695423b的发明专利)。由于md疫苗能够预防肿瘤的形成，但不能阻止mdv野毒株的感染，疫苗毒株可以与野毒株共存于鸡体内。而表达ibdv vp2基因的重组mdv疫苗株作为可以预防md和ibd的二价活疫苗，在鸡体内疫苗毒株和野毒株的鉴别检测对于md的诊断、疫苗的免疫监控等都具有重要意义。目前尚没有一种有效的、准确的区分表达ibdv vp2基因的重组mdv疫苗株和野毒株的pcr检测方法。

技术实现思路

1、为了鉴别检测表达ibdv vp2基因的重组mdv疫苗株(rmdv-vp2)与其他不含有ibdvvp2基因的mdv毒株，进而实现md的诊断及监控表达ibdv vp2基因的重组mdv疫苗株的免疫情况，本发明针对外源插入片段中的目的基因序列设计上游引物vp2f，针对亲本病毒缺失片段设计上游引物us2pf，针对插入位点3’端旁侧序列设计下游引物us2r，利用上述引物，以待测病毒基因组dna为模板进行pcr扩增，可以特异性检测重组疫苗株rmdv-vp2中的外源插入片段及插入位置，并且可以区分rmdv-vp2与其他不含有ibdv vp2基因的mdv毒株。

2、为解决上述技术问题并达到相应的技术效果，本发明提供了如下技术方案：

3、本发明的第一个目的是提供了一种用于鉴别表达传染性法氏囊病病毒vp2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株的引物，所述引物包括核苷酸序列如seq id no.1所示的上游引物vp2f和核苷酸序列如seq id no.3所示的下游引物us2r。

4、本发明的第二个目的是提供上述引物在制备用于鉴别表达传染性法氏囊病病毒vp2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株的试剂盒中的应用。

5、本发明的第三个目的是提供一种含有上述引物的试剂盒。

6、本发明的第四个目的是提供上述引物或上述试剂盒在鉴别表达传染性法氏囊病病毒vp2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株中的应用。

7、本发明的第五个目的是提供一种用于区分表达传染性法氏囊病病毒vp2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株与不含有传染性法氏囊病病毒vp2基因的鸡马立克氏病病毒的引物，所述引物包括核苷酸序列如seq id no.1所示的上游引物vp2f、核苷酸序列如seq idno.2所示的上游引物us2pf和核苷酸序列如seq id no.3所示的下游引物us2r。

8、本发明的第六个目的是提供上述引物在制备用于区分表达传染性法氏囊病病毒vp2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株与不含有传染性法氏囊病病毒vp2基因的鸡马立克氏病病毒的试剂盒中的应用。

9、本发明的第七个目的是提供一种含有上述引物的试剂盒。

10、本发明的第八个目的是提供上述引物或上述试剂盒在区分表达传染性法氏囊病病毒vp2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株与不含有传染性法氏囊病病毒vp2基因的鸡马立克氏病病毒中的应用。

11、本发明的第九个目的是提供一种区分表达传染性法氏囊病病毒vp2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株与不含有传染性法氏囊病病毒vp2基因的鸡马立克氏病病毒的方法，所述方法以待测病毒基因组dna为模板，使用核苷酸序列如seq id no.1所示的上游引物vp2f、核苷酸序列如seq id no.2所示的上游引物us2pf和核苷酸序列如seq id no.3所示的下游引物us2r进行pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳判断扩增产物的片段大小，若扩增产物片段大小为2840bp，则待测病毒为表达传染性法氏囊病病毒vp2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株；若扩增产物片段大小为814bp，则待测病毒为不含有传染性法氏囊病病毒vp2基因的鸡马立克氏病病毒。

12、在本发明的一种实施方式中，所述pcr反应的体系为5×prime star gxl反应缓冲液10μl，2.5mmol/l的dntp mixture 4μl，10pmol/μl的上游引物vp2f、上游引物us2pf和下游引物us2r各1μl，1.25u/μl的primestar gxl dna polymerase 1μl，100ng/μl的基因组dna 1μl，双蒸水31μl。

13、在本发明的一种实施方式中，所述pcr反应的程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸3min，35个循环；72℃再延伸10min。

14、本发明的第十个目的是提供上述方法在诊断鸡马立克氏病或监控表达传染性法氏囊病病毒vp2基因的重组mdv疫苗株的免疫情况中的应用。

15、本发明的有益效果：

16、为了区分表达ibdv vp2基因的重组mdv疫苗株与其他不含有ibdv vp2基因的mdv毒株，进而实现md的诊断及监控表达ibdv vp2基因的重组mdv疫苗株的免疫情况，本发明根据重组疫苗株与亲本毒的差异主要在于重组疫苗株含有vp2基因表达框架(亲本病毒没有)，同时重组疫苗株缺失了us2基因部分序列(亲本病毒含有)的特征，针对外源插入片段中的目的基因序列设计上游引物vp2f，针对亲本病毒缺失片段设计上游引物us2pf，针对插入位点3’端旁侧序列设计下游引物us2r。利用引物vp2f和us2r进行pcr，能够特异性检测重组疫苗株(rmdv-vp2)中的外源插入片段及插入位置；利用引物vp2f、us2pf和us2r进行pcr，可以区分重组疫苗株(rmdv-vp2)与其他不含有ibdv vp2基因的mdv毒株。本发明提供的pcr方法能鉴别检验表达ibdv vp2基因的重组mdv疫苗株与其他mdv毒株，对于鸡马立克氏病的诊断、疫苗的免疫监控等具有重要意义。